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这篇综述聚焦野生动物犯罪领域，探讨非 PCR DNA 技术在物种鉴定中的应用。文中详细介绍了等温扩增（如 LAMP、RCA、RPA）、靶向检测（CRISPR、适配体）等方法，分析其优势、局限，还讨论面临的挑战及未来方向，对相关研究意义重大。
1. 引言
野生动物犯罪是非法利用和交易野生动物的行为，其规模庞大且利润丰厚，与毒品、武器走私类似。《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES，1973）对其进行国际监管。野生动物法医科学在打击这类犯罪中至关重要，主要解决物种鉴定、样本个体关联和物种地理起源确定等问题。
传统的物种鉴定多依赖形态学特征，但这种方法主观性强，在处理加工过的物品或形态相似物种时存在局限。因此，遗传方法逐渐受到重视。近年来，科研、执法和保护领域对快速、简便的物种鉴定方法需求增加，促使人们探索新的技术途径。
2. 野生动物犯罪
野生动物犯罪是全球非法产业，价值估计在 100 - 200 亿美元之间，但因其非法性，准确数值难以确定。全球贩运网络涉及多方，且常与其他犯罪活动相关联。
CITES 将超 40,000 种物种分类保护，附录 I 中的物种如大象、穿山甲、老虎等面临极高灭绝风险。各签署国设立管理和科学机构，负责监管和制定贸易配额。例如，新西兰通过《濒危物种贸易法》（1989）保护相关物种。
3. 当前野生动物犯罪物种鉴定方法
3.1 形态学分析
形态学分析通过观察动物的外部身体部位和内部结构来鉴定物种，但该方法存在主观性，依赖专业知识，在处理加工食品、装饰品、药品等特殊样本时难以适用，且对于形态相似但遗传不同的物种也难以准确区分。
3.2 DNA 基于 DNA 的方法
在下一代测序（NGS）技术出现前，直接扩增长度多态性（DALP）、定向扩增小卫星区域 DNA（DAMD）和 PCR - 限制性片段长度多态性（PCR - RFLP）等方法被广泛应用，但它们对 DNA 质量和数量要求高，重现性差，结果解释困难。
NGS 技术的发展带来变革，DNA 代谢条形码技术可同时分析多个基因区域，通过通用引物扩增动植物标记生成 DNA 条形码进行物种鉴定。例如，常用的动物标记有细胞色素 B（CytB）、细胞色素 C 氧化酶 1（COI）、16S 核糖体 RNA（16S rRNA）等，植物标记有成熟酶 K（matK）、核酮糖 - 1,5 - 二磷酸羧化酶（rbcL）、内转录间隔区（ITS）等。该技术对处理复杂样本和低质量 DNA 样本效果良好。
牛津纳米孔技术（ONT）的纳米孔测序具有便携性优势，但错误率较高。不过，通过改进测序化学、碱基识别算法和自适应采样等技术，其准确性得到提升，已在野生动物犯罪物种鉴定中得到应用。
基于 PCR 的方法虽已成熟，但新兴的核酸扩增技术（NAATs），如等温扩增方法，具有更快、更简便、成本效益更高的优势，更适合现场检测。
4. 物种鉴定的替代扩增方法
替代 NAATs 包括等温扩增方法（如 LAMP、RCA、RPA）和靶向检测方法（如 CRISPR、适配体），这些方法可与侧向流动分析（LFA）或微流控设备结合，简化样本制备和可视化过程。在 COVID - 19 大流行期间，NAATs 技术在快速抗原检测（RATs）中的广泛应用，展示了其潜力。
4.1 环介导等温扩增（LAMP）
LAMP 是一种快速、灵敏、特异且稳健的方法，已应用于病原体检测、食品认证和 CITES 物种鉴定等领域。它通过多引物介导的链置换反应在恒温下扩增 DNA，添加环引物可提高扩增效率。
LAMP 反应的阳性结果可通过浊度、比色法或荧光法检测。为满足便携性和不同通量需求，已有商业设备用于检测 LAMP 扩增。LFA 可与荧光 LAMP 结合，简化分析过程。
LAMP 灵敏度高，特异性强，在区分近缘物种方面有优势，但存在引物设计复杂、多重检测能力有限、易出现非特异性扩增和污染等问题。使用时，基于视觉指标的结果应视为推定结果，需通过测序确认。
4.2 滚环扩增（RCA）
RCA 是一种等温扩增方法，源于细菌和病毒的滚环复制过程。它利用单链环状模板、聚合酶和引物进行扩增，具有所需试剂和设备少、可在 37°C 恒温进行的优势，适合现场检测。
RCA 产物的可视化方法多样，包括比色法、荧光法等，还可与微流控设备或 LFA 结合。但该方法在鉴定 CITES 物种方面应用较少，因其需要环状模板，增加了实验步骤和复杂性。
4.3 重组酶聚合酶扩增（RPA）
RPA 是一种等温扩增方法，常用于检测细菌、真菌、寄生虫等，也用于食品认证。它具有操作简便、反应快速、对抑制剂耐受性强的特点，相比其他等温方法，RPA 结果更快速，检测设计更简单，便于多重检测。
RPA 已在肉类产品动物物种检测中得到应用，但它也存在局限性，如缺乏专用引物设计软件，引物较长影响对降解样本的检测，商业试剂盒有限导致试剂成本高。
5. 等温扩增方法的靶标检测
5.1 成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）
CRISPR 是强大的工具，广泛应用于多个领域。其核心组件包括引导 RNA（gRNA）、Cas 效应蛋白和信号转导器。Cas12 和 Cas13 系统利用反式切割活性，通过荧光标记实现对目标 DNA 或 RNA 的高灵敏度、快速、特异性检测。
CRISPR - Cas 系统可直接检测目标序列，也可与扩增方法结合提高对低丰度目标的检测灵敏度。其可视化方法多样，已在物种鉴定中展现潜力，但将其整合到工作流程中会增加复杂性和成本。
5.2 适配体
适配体是能特异性结合多种目标的单链 DNA 或 RNA 配体，通过 SELEX 过程筛选获得。它在病原体检测、食品安全等领域应用广泛，常与预扩增方法结合提高灵敏度，还可用于目标捕获，避免 DNA 提取步骤。尽管适配体检测设计复杂，但在现场检测中具有重要潜力。
6. 野生动物物种鉴定中基于 DNA 方法的常见挑战
6.1 技术挑战
野生动物犯罪样本类型多样，DNA 提取效率受样本质量、降解程度和抑制剂影响。复杂的提取过程限制了现场检测，微流控设备可简化提取流程，提高检测效率，使现场检测更可行。
6.2 结果解释挑战
准确的物种鉴定依赖高质量的参考数据，但现有公共数据库质量参差不齐，内部数据库建设和维护成本高。因此，需要全球合作建立全面可靠的数据库，以提高物种鉴定的准确性。
6.3 方法标准化
野生动物犯罪案件的物种鉴定需科学可靠，目前该领域缺乏标准化方法，不同实验室操作差异大。相关组织已发布部分标准和指南，但需纳入新技术，扩大熟练度测试范围，以增强物种鉴定的一致性和可信度。
7. 结论和未来方向
等温扩增方法（LAMP、RCA、RPA）与靶向检测方法（CRISPR、适配体）结合，具有快速、简便、成本效益高的优势，可补充传统 PCR 和 NGS 方法，加速野生动物犯罪案件处理。
新兴技术如人工智能（AI）可优化样本处理和报告流程，区块链技术可追踪野生动物产品，助力打击网络非法交易。这些技术的整合将提升野生动物犯罪检测的效果，保护濒危物种及其生态系统。
