《Fungal Ecology》：Evaluation of soil fungal communities using the ITS2 sublocus and 18S gene primers under different amplification methods
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为解决引物选择和 PCR 方法影响真菌群落研究准确性的问题，研究人员开展土壤总真菌和丛枝菌根真菌（AMF）群落研究。结果显示不同引物和 PCR 方法影响显著，该研究为评估地下真菌群落提供指导。
在生态研究领域，土壤中的真菌如同隐藏在地下的 “神秘大军”，对生态系统的稳定和发展起着至关重要的作用。它们有的像勤劳的 “分解者”，将有机物转化为植物能吸收的养分；有的作为 “互利共生者”，与植物根系携手共进，帮助植物吸收更多的水分和营养；但也有一些是会危害植物健康的 “病原体” 。
然而，想要清晰地认识这支 “神秘大军” 的组成和结构并非易事。随着分子生物学技术的发展，基于 DNA 的研究方法逐渐成为探索真菌世界的重要工具。不过，在实际操作过程中，研究人员却遇到了不少难题。首先，用于真菌分类的 DNA 条形码缺乏统一标准，这使得对真菌多样性的准确评估困难重重。其次，引物的选择性和 PCR 扩增方法的差异，也会像迷雾一样，干扰对真菌群落的真实判断。比如，常用的 ITS 区域作为 DNA 条形码，虽然有一定优势，但针对 ITS2 区域的 DNA 扩增，却容易低估包括 AM 真菌（Arbuscular Mycorrhizal Fungi，丛枝菌根真菌，是许多生态系统中重要的共生真菌）在内的球囊霉亚门的多样性。在面对恶劣、极端或受干扰环境中低含量的 DNA 样本时，如何选择合适的引物和 PCR 方法，成为了摆在科研人员面前的一道难题。
为了驱散这些研究道路上的 “迷雾”，来自多个国家研究机构的研究人员共同开展了一项深入的研究。他们的研究成果发表在《Fungal Ecology》杂志上。
研究人员主要采用了高通量测序技术（对大量 DNA 分子进行快速测序的技术）。研究样本来自三大洲六个国家不同植物主导生态系统的根和土壤，包括塞内加尔河的半热带天然盐渍农田、刚果民主共和国的热带森林休耕区、南非的热带矿区、加拿大的北方矿区以及其他未提及完整信息的地点。
下面来看看具体的研究结果：
- 分类和组成差异：对 ITS 区域扩增子测序数据处理后发现，ITS3tagmix4/ITS4ngs 和 ITS3tagmix1 - 5/ITS4ngs 引物组分别回收了 3,076,219 和 2,469,094 条序列读数，质量过滤后保留 2,011,201 和 1,473,663 条序列，共产生 5,701 个扩增子序列变异（ASVs，可用于代表微生物群落中的独特分类单元）。这表明不同引物组在获取序列信息上存在差异。
- 不同引物对特定菌群的特异性：在针对 18S rRNA 基因的特异性引物中，AMV4.5NF/AMDGR 对球囊霉科有不同的特异性，而 SSU515Fngs/Euk742R 对类球囊霉科有不同的特异性。这说明不同引物对特定的真菌类群有着不同的识别能力。
- PCR 方法对 AMF 群落的影响：无论采样地点如何，PCR 方法（巢式 PCR 和非巢式 PCR）对 AMF 群落结构的影响比引物选择更大，不过引物选择对 AMF 丰富度有显著影响。巢式 PCR 虽然常用于解决低 DNA 产量问题，但可能增加 PCR 偏差，进而影响土壤真菌群落的分类评估，且这种影响可能因环境而异。
- 最佳引物组的确定：综合研究结果表明，扩增 ITS2 区域的 ITS3tagmix1 - 5/ITS4ngs 引物组是使用代谢条形码表征总真菌群落的最合适引物组。该引物组产生的高质量读数比例最高，在从不同环境收集的土壤和根样本中，对总真菌的检测能力更强。
从研究结论和讨论部分可以看出，这项研究意义重大。它明确了在评估不同环境样本中的地下真菌群落时，引物选择和扩增方法的重要性。为后续研究提供了生态相关的指导，帮助科研人员在面对复杂的土壤真菌群落研究时，能够更准确地选择合适的引物和 PCR 方法，从而更可靠地评估真菌群落的多样性和组成，为生态系统的可持续管理、土壤修复以及生物多样性保护等方面提供了有力的科学依据。
