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在 RNA 测序（RNA-seq）用于真菌研究时，内参基因选择影响数据准确性。研究人员分析曲霉属黑曲霉（Aspergillus niger）转录组数据，鉴定出 44 个候选内参基因，其中 26 个在多种真菌中表达稳定，优于传统内参基因，有助于提升转录组数据标准化分析。
在生命科学研究的广袤领域中，RNA 测序（RNA-seq）技术宛如一把神奇的钥匙，开启了探索基因组转录奥秘的大门。它能够高通量地分析不同条件下基因组产生的 RNA 转录本，为科学家们揭示生物分子机制提供了有力工具。在真菌研究领域，RNA-seq 也被广泛应用，极大地推动了对真菌生理和遗传调控的理解。比如，它帮助研究者深入探究真菌降解植物生物质的分子机制，了解真菌病原体与植物宿主之间的相互作用，以及真菌生长发育的调控过程 。
然而，RNA-seq 数据的分析却面临着诸多挑战。其中，数据归一化是关键的一环。因为在实验过程中，生化和技术流程会引入各种系统噪声，像测序深度、转录本长度、GC 含量、RNA 降解，以及 RNA 分离、纯化、逆转录和 cDNA 扩增过程中的差异等。这些因素会导致原始数据无法直接进行准确的基因表达比较。目前常用的归一化方法，如 RPKM/FPKM（每千碱基转录本每百万映射读取数 / 片段数）和 TPM（每百万转录本数），都基于一些不太符合实际情况的假设，在某些条件下可能会给出不准确的结果。还有像 DESeq2 和 Limma 等方法，也存在一定的局限性，当实验条件影响超过半数基因的表达水平时，它们的可靠性就会大打折扣。因此，寻找稳定表达的内参基因，成为提高转录组分析准确性的关键，对于广泛应用的逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）实验来说同样至关重要，因为在该实验中，候选基因的初始表达水平需要用稳定表达的内参基因进行标准化。
在这样的背景下，来自未知研究机构的研究人员开展了一项旨在鉴定真菌内参基因的研究。他们的研究成果发表在《Fungal Genetics and Biology》杂志上，为该领域带来了新的突破。
为了开展这项研究，研究人员利用了多个 RNA-seq 数据集。这些数据集涵盖了黑曲霉不同的生长条件和基因型，包括不同菌株在不同碳源、不同时间点的转录组数据。他们运用了多种技术方法，其中关键的是基于变异分析来鉴定内参基因。具体来说，研究人员通过计算变异系数（CV），基于 TPM、DESeq2 和 Limma 三种不同的归一化方法来筛选稳定表达的基因。同时，他们还借助基因功能注释、表达可视化和正调控分析等技术，对候选内参基因进行深入研究。
下面我们来详细看看研究的结果：
- 鉴定候选内参基因：研究人员通过对七个不同的 RNA-seq 数据集，基于三种独立的归一化方法进行分析，经过筛选，最终确定了 44 个核心候选内参基因。这些基因在不同的数据集和检测方法中都能被稳定检测到。有趣的是，其中既包含了一些传统的常用内参基因，也有很多新发现的基因。而一些以往常用的内参基因，如组蛋白 H2B、H4，肌动蛋白（act）、甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶（gapdh）等，却没有出现在这个核心集合中，因为它们在部分数据集里表达并不稳定。
- 新候选内参基因与基本生物活动相关：对这些候选内参基因进行功能注释后发现，它们与许多基本的生物活动密切相关。比如，有多个基因编码 26S 蛋白酶体调节亚基和 20S 蛋白酶体调节亚基，这些都参与了真核细胞中保守的泛素蛋白酶体途径，负责靶向蛋白质降解。还有液泡 H+-ATP 酶（V-ATPase）的多个亚基，V-ATPase 是一种重要的质子泵，在众多生物过程中发挥作用。此外，线粒体导入蛋白、Ras 相关的 GTP 酶等相关基因也被鉴定为候选内参基因，这些都表明这些基因在维持细胞基本功能方面的重要性，也解释了它们作为内参基因的稳定性。
- 新鉴定的候选内参基因在不同真菌物种中表达稳定：研究人员进一步分析了这些候选内参基因在其他四种真菌（构巢曲霉、微红青霉、里氏木霉、黄孢原毛平革菌）中的表达情况。通过正调控分析发现，44 个黑曲霉候选内参基因中有 35 个是单拷贝基因，并且在其他四种真菌中有对应的单拷贝直系同源基因。其中 26 个基因在这五种真菌的转录组数据中都表现出稳定表达，这充分说明了这些基因功能的保守性，也进一步证明了它们作为内参基因的潜力。
- 新鉴定的候选内参基因比常用内参基因表达更稳定：研究人员将新鉴定的 26 个稳定表达基因与常用的九个内参基因进行比较。结果发现，像ubc、sarA、act和h2B这四个常用基因，表达稳定性与新鉴定的基因相当，不过sarA、act和h2B仅在基于 TPM 的方法中被鉴定出来。而另外五个常用基因（cox5、α- 微管蛋白（α-tubulin）、18S 核糖体 RNA 基因（18S rRNA）、gapdh和h4）表达变化较大。总体而言，新鉴定的 26 个候选基因在所有七个数据集中的 CV 方差更小，表达更稳定。这意味着常用的很多内参基因可能并不适合用于基因表达数据的标准化，在 RT-qPCR 和转录组归一化分析中可能会导致错误结论。而新鉴定的候选基因虽然还需要在更多实验条件下进一步验证，但已经展现出了作为新内参基因的巨大潜力。
综合来看，研究人员通过对大型转录组数据集进行严格的统计分析，成功鉴定出 26 个保守的真菌内参基因。这些基因在广泛的实验条件和真菌基因型中都表现出极其稳定的表达。它们的发现为转录组数据的归一化分析提供了更可靠的选择，有助于提高当前 RT-qPCR 实验以及多个转录组数据集综合分析的准确性，为真菌研究领域的发展注入了新的活力，让科学家们在探索真菌奥秘的道路上能够更加准确地解读基因表达信息，推动相关领域的进一步发展。
