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本文是关于细胞外囊泡（EVs）在癌症免疫治疗领域的综述。主要探讨了 EVs 的定义、起源、分类，其在癌症免疫中的复杂作用，包括促进或抑制肿瘤进展。还介绍了相关临床应用、作为癌症疫苗和药物载体的潜力，以及面临的挑战和未来方向。
1. 引言
癌症是全球主要死因，2022 年全球约有 2000 万新癌症病例和近 1000 万癌症死亡病例。主要治疗方法有化疗、放疗、冷冻消融和手术等，而精准治疗和免疫治疗（如免疫检查点抑制剂（ICI）、溶瘤病毒疗法等）能靶向肿瘤细胞且副作用小。癌症免疫治疗主要通过调节肿瘤免疫微环境（TIME），让免疫细胞对抗癌细胞。
细胞外囊泡（EVs）在癌症免疫调节研究中逐渐受到关注。EVs 是由细胞释放到细胞间隙的磷脂双层膜包裹的颗粒，根据来源、大小等可分为外泌体（Exos）、微囊泡（MVs）和凋亡小体（Apo-EVs）。它们能在正常和病理状态下通过传递核酸、脂质和蛋白质等生物材料，促进细胞间相互作用。基于 EVs 的疗法旨在对抗肿瘤微环境刺激产生的免疫逃逸，可作为药物载体，激活免疫细胞，减少癌症进展。
2. EVs：定义和起源
国际细胞外囊泡协会（ISEV）推出了相关指南，以优化不同 EV 类型的分离和分类。EV 的产生受外部刺激、生物发生调控和培养系统的影响，优化培养条件和结合合成脂质体可提高产量。
2.1. 外泌体（Exo）
Exos 在 20 世纪 80 年代被发现，大小通常在 30 - 150nm。它由多泡体（MVBs）与质膜向内出芽融合，释放腔内小泡（ILVs）形成，ILVs 再与细胞膜融合，将 Exos 释放到细胞外环境。Exos 的膜由多种磷脂和蛋白质组成，具有独特的形态。其生物发生主要通过内体分选转运复合体（ESCRT）依赖机制和替代途径。
2.1.1. ESCRT 依赖的 Exo 生物发生
ESCRT 依赖途径是 Exo 产生的主要机制，涉及 ESCRT - 0、-I、-II 和 -III 以及内体膜去泛素化酶。例如，HGS（ESCRT - 0）对 Exo 生成至关重要，GPR143 则在调节该途径中起关键作用，影响癌细胞的运动和转移。
2.1.2. Exo 生物发生的替代途径
Exos 还可通过 G 蛋白（如 Ras 超家族、ADP 核糖基化因子 6（ARF6））、磷脂酶 D2（PLD2）和 syndecan 结合蛋白 syntenin 等过程形成。此外，自噬依赖的分泌组和双微体形成等替代途径也对 Exo 生物发生至关重要，为疾病治疗提供了潜在靶点。
2.2. 微囊泡
微囊泡（MVs）也叫血小板尘埃，是从细胞膜脱落的膜结合囊泡，直径在 100nm - 1000nm，甚至可达 10000nm。其产生涉及磷脂重排，如磷脂酰丝氨酸（PS）外化和收缩装置激活，钙离子（Ca2+）内流可触发其生物发生。
2.3. 凋亡小体
凋亡小体（Apo-EVs）大小在 1000 - 5000nm，在细胞凋亡过程中产生，可能包含碎片化的细胞内细胞器和核成分。其膜成分反映了凋亡过程中母细胞表面的变化，大部分 Apo-EVs 被巨噬细胞清除，部分可传递信息给其他细胞。
2.4. EV 货物
EVs 包裹和运输蛋白质、脂质、核酸、代谢物和非编码 RNA 等成分。这些成分的组成和数量影响 EV 的形成和分泌。例如，EVs 含有与生物合成、生成和分泌相关的蛋白质，以及多种膜蛋白和脂质。其遗传物质也非常多样。
2.5. EV 功能
EVs 通过将蛋白质和脂质传递到靶细胞膜上的受体，促进与靶细胞质膜的融合，从而在生物过程中发挥重要作用。它们参与维持正常生理功能，如干细胞维持、组织修复等，同时也在癌症发展中起作用，具有潜在的治疗价值，尤其是在免疫治疗方面。
3. EVs 分离和表征
3.1. EV 分离
目前缺乏标准化的 EV 收集、分离和保存程序。不同的分离方法各有优缺点，且由于 EVs 直径小，分离过程易受污染。常用的分离方法包括差速超速离心、聚合物沉淀、免疫亲和捕获和尺寸排阻色谱等。
3.1.1. 差速超速离心
差速超速离心是最早用于分离 EVs 的技术，基于 EVs 的密度、大小和形状进行分离。但该方法存在一些问题，如难以从高粘性生物流体中回收 EVs，且获得的沉淀物可能含有杂质。
3.1.2. 聚合物沉淀
聚合物沉淀通过样品与试剂的相互作用进行相分离，但高离心力可能影响 EVs 的完整性，且易共分离出不需要的蛋白质，导致杂质。
3.1.3. 免疫亲和捕获
免疫亲和捕获基于 EV 表面抗原，利用抗体识别 EV 受体或生物标志物，可分离特定来源的 EVs，但存在成本高、产量低等问题。
3.1.4. 尺寸排阻色谱
尺寸排阻色谱根据 EVs 的大小进行分离，能有效分离 EVs 与蛋白质背景，但也可能存在少量类似大小的杂质。
3.2. EV 表征
对 EVs 的表征包括物理和生化方法。
3.2.1. 物理表征
纳米颗粒跟踪分析（NTA）可测量 EVs 的大小和浓度，还能计算 zeta 电位；单粒子干涉反射成像（SP - IRIS）测量更可靠；电阻脉冲传感（RPS）和流式细胞术（FCM）也可用于 EVs 表征。
3.2.2. 生化表征
生化表征包括抗体亲和标记、核酸测序（NA - Seq）和质谱（MS）。NA - Seq 用于鉴定和定量 EVs 中的 RNA，MS 分析脂质和蛋白质成分，抗体亲和标记分析 EV 内容物和细胞来源的 EVs。
4. EVs 在癌症免疫中的独特性质
EVs 在癌症免疫学中的功能复杂且动态，可促进或抑制肿瘤进展。肿瘤细胞释放的 EVs 比非肿瘤细胞多，靶向其机制或成分有望开发抗肿瘤疗法。Exos 在调节抗癌免疫反应中起关键作用，可作为抗癌疫苗，但癌症来源的 Exos 也可能抑制免疫反应。此外，EVs 还可调节 T 淋巴细胞、NK 细胞等的活性。
5. 异质性 EVs 在癌症中的多样功能
EVs 在大小、组成和生物功能上表现出异质性。
5.1. 异质性 EVs 及其不同的生物标志物
不同类型的 EVs 在蛋白质谱等方面存在差异，为识别肿瘤潜在生物标志物提供了新视角。
5.2. 异质性 EVs 在癌症生长和转移中的不同作用
不同来源的 EVs 对癌细胞生长和转移的影响不同。例如，某些细胞来源的 Exos 可促进癌细胞生长和运动，而另一些细胞来源的 MVs 则可能有不同作用。此外，Exos 中的整合素在癌症转移中起重要作用。
5.3. 异质性 EVs 在凝血活性和癌症免疫中的不同作用
不同类型的 EVs 在凝血活性和癌症免疫中也有不同表现。如 Apo-EVs 在体外凝血试验中表现出较高的止血活性，在癌症免疫防御中也有重要作用。
6. 临床试验和 EVs 的治疗潜力
EVs 在治疗多种疾病方面具有潜力，可作为药物载体、癌症疫苗和生物标志物。临床应用已经取得了一些进展，多项临床试验正在开展，探索其在癌症治疗和生物标志物识别方面的应用。例如，植物来源的 Exos 可有效将姜黄素递送至结肠肿瘤，MSC 来源的 Exo 与 siRNA 结合可靶向转移性胰腺癌。
7. EVs 在癌症免疫治疗中的潜力
免疫细胞来源的 EVs 可调节免疫反应，增强抗肿瘤免疫力。例如，NK 细胞来源的 EVs 含有细胞毒性蛋白，可促进癌细胞凋亡；DC 来源的 EVs（DCEVs）具有免疫刺激特性，可激活免疫系统；巨噬细胞来源的 EVs 在肿瘤免疫中具有双重作用；T 细胞和 B 细胞来源的 EVs 也参与免疫调节。肿瘤来源的 EVs（TEVs）虽可促进肿瘤生长，但也含有免疫原性成分，可作为癌症疫苗。此外，工程化免疫细胞来源的 EVs 为免疫治疗开辟了新方向。
8. EVs 及其作为癌症疫苗的作用
疫苗分为预防性和治疗性，癌症疫苗主要用于治疗现有癌症。DC 来源的 EVs（DEXs）是最早应用于临床的癌症疫苗之一，具有较高的稳定性和免疫刺激作用。TEVs 含有肿瘤相关抗原（TAAs）和肿瘤特异性抗原（TSAs），可作为治疗性癌症疫苗，但也存在促进肿瘤生长和免疫抑制的风险。此外，其他细胞来源的 EVs，如人类胚胎干细胞、T 细胞、NK 细胞等分泌的 EVs，以及革兰氏阴性菌分泌的外膜囊泡（OMVs），都在癌症疫苗开发中展现出潜力。
9. EVs 在癌症药物递送中的作用
EVs 是优化癌症药物递送的有前景的候选者，具有天然靶向能力和较低免疫原性，可有效运输药物到肿瘤部位，穿越生物屏障，逃避吞噬作用。工程化 EVs 可提高肿瘤特异性，减少全身毒性。常用的 EVs 加载方法包括电穿孔、超声处理和挤压等，还可通过基因工程增强靶向性。临床前研究显示，EVs 作为药物递送系统具有潜力，但转化为临床应用仍面临一些挑战，如细胞来源对 EVs 的影响、标准化监管指南的缺乏等。
10. EVs 作为肿瘤生物标志物的作用
EVs 作为肿瘤生物标志物具有诸多优势，如在多种体液中丰富，可实现微创采样，且携带多种可测量的生物分子，能提高诊断的敏感性和特异性。EVs - 基于的液体活检可用于早期癌症检测和监测治疗效果。此外，EVs 中的核酸和蛋白质等可作为生物标志物，用于预测疾病状态和治疗反应。但目前存在一些问题，如 EVs 的异质性、缺乏标准化的分离和表征方法等。
11. 基于 EVs 的癌症免疫治疗的挑战和未来方向
基于 EVs 的癌症免疫治疗面临诸多挑战，如 Exos 的分离和有效利用困难，其生物学功能尚未完全明确，分离方法缺乏标准化，且缺乏体内研究数据。此外，治疗性 Exos 的存储、制造和生物安全性等问题也有待解决。未来需要开发标准化、高效的 EVs 分离和表征方法，优化存储和制造过程，开展更多临床研究，以充分发挥 EVs 在癌症免疫治疗中的潜力。
12. 结论
EVs 在癌症研究中具有重要意义，在癌症治疗，尤其是免疫治疗方面展现出巨大潜力，可作为药物递送系统和肿瘤生物标志物，癌症疫苗开发也有前景。然而，要将其广泛应用于临床实践，还需解决诸多挑战，如标准化方法的建立、对其生物学功能的深入理解、生产规模的扩大以及安全性和有效性的验证等。
