利用聚嘌呤反向Hoogsteen发夹抑制PCSK9：一种新型基因治疗策略在降胆固醇领域的突破性研究

本研究针对高胆固醇血症治疗中PCSK9抑制剂的成本高、安全性等问题，开发了基于聚嘌呤反向Hoogsteen发夹（PPRH）的基因沉默技术。通过设计靶向PCSK9外显子9和12的PPRH分子（HpE9/HpE12），在体外实现PCSK9 mRNA降低74%，蛋白降低87%；在转基因小鼠中单次注射使血浆PCSK9和胆固醇水平分别下降50%和47%，且无毒性反应。该技术为开发低成本、高效安全的PCSK9抑制剂提供了新思路。

　　

高胆固醇血症是心血管疾病的主要风险因素，而PCSK9（前蛋白转化酶枯草溶菌素9型）作为调控低密度脂蛋白受体（LDLR）降解的关键靶点，已成为降脂治疗的重要突破口。尽管单克隆抗体（如evolocumab/alirocumab）和siRNA药物（如Inclisiran）已应用于临床，但其高昂成本和长期用药需求仍是重大挑战。为此，来自美国俄勒冈健康与科学大学和西班牙巴塞罗那大学的研究团队在《Biochemical Pharmacology》发表了一项创新性研究，首次将聚嘌呤反向Hoogsteen发夹（PPRH）技术应用于代谢性疾病领域，开发出能高效沉默PCSK9的新型基因治疗策略。

研究团队通过生物信息学筛选，设计了靶向PCSK9外显子9（HpE9）和外显子12（HpE12）的PPRH分子。采用电泳迁移率变动分析（EMSA）证实其与靶序列结合的解离常数（K_d）达10^-7-10^-8 M级；动态光散射（DLS）显示其与阳离子聚合物jetPEI形成的纳米颗粒（167 nm）可实现高效递送。在细胞和动物模型中，通过实时定量PCR、Western blot和ELISA等技术系统评估了基因沉默效果及安全性。

3.1 PPRH分子设计与结合特性
研究通过Triplex Forming Oligonucleotide工具筛选出PCSK9基因的靶向位点，设计的HpE9和HpE12分别靶向外显子9和3'-UTR区。EMSA实验显示两者与单链靶序列形成三链体结构，HpE9结合力更强（K_d=7.86×10^-8 M vs HpE12的7.58×10^-7 M），为后续功能研究奠定基础。

3.2 递送系统优化
采用jetPEI聚合物包裹PPRH形成纳米复合物（N/P比=8），粒径167.8±0.3 nm。荧光标记实验证实91%的HepG2细胞在24小时内有效内化复合物，且无细胞毒性，解决了核酸药物的递送难题。

3.3 体外抑制效果
在HepG2细胞中，250 nM PPRH处理24小时即可使PCSK9 mRNA降低63-74%，成熟蛋白（62 kDa）减少89-96%。值得注意的是，LDLR蛋白水平随之升高218%，证实了PPRH通过抑制PCSK9-LDLR通路增强胆固醇清除的机制。

3.4 体内疗效验证
在hPCSK9转基因小鼠中，单次腹腔注射HpE12（100 μg）使血浆PCSK9水平48小时内下降48%，伴随总胆固醇降低47%，且效果可持续至第7天。对照实验证实该效应具有序列特异性，靶向生存素基因的PPRH（HpSurv）无此作用。

3.5 安全性评估
野生型小鼠接受两次40 μg HpE9注射后，肝功能指标（ALT/AST）和炎症因子（TNFα/CRP）均无异常，器官重量和体重保持稳定，证明PPRH具有良好的生物相容性。

这项研究首次将PPRH技术拓展至代谢疾病领域，其优势在于：①使用非修饰DNA序列降低成本；②三链体结构提供高稳定性（半衰期长于siRNA）；③可逆性基因沉默避免CRISPR的永久性基因编辑风险。与现有疗法相比，PPRH能直接降低PCSK9转录水平，而非像单抗那样导致循环PCSK9蓄积。研究者建议未来可探索GalNac（N-乙酰半乳糖胺）靶向递送以增强肝脏特异性，或与statins（他汀类药物）联用以实现协同降脂。该技术为开发"可负担的基因药物"提供了全新范式，不仅适用于高胆固醇血症，也为PCSK9相关肿瘤、感染等疾病的治疗开辟了新路径。