动态启动子工程助力解脂耶氏酵母高效合成3-羟基丙酸：遗传工具包扩展与百克级产量突破

本研究针对解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)遗传调控工具匮乏的瓶颈，通过转录组分析和功能筛选构建了包含82个梯度强度启动子和34个生长期响应型启动子的工具包，并鉴定出活性比pTEFin高0.76-1.00倍的强启动子PU12/PU13/PC48。研究团队创新性地采用模块化策略：梯度启动子平衡MCR功能域表达，动态启动子调控脂肪酸合成竞争途径，强启动子强化丙二酰-CoA供给，最终实现3-HP产量100.37 g/L（酵母体系最高记录），为动态微生物细胞工厂设计提供了范式。

　　

在绿色生物制造的浪潮中，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)因其卓越的有机酸耐受性和脂质积累能力，被视为生产平台化学品的理想宿主。然而，这种非传统酵母面临着一个关键瓶颈——缺乏精确调控的遗传工具，特别是能够动态响应细胞生理状态的启动子系统。这种局限性严重制约了其工业化应用潜力，尤其是在3-羟基丙酸(3-HP)等高价化合物的生产中。3-HP作为合成生物可降解塑料和丙烯酸的关键前体，其微生物合成路线备受关注，但现有工程菌株的产量与生产成本仍无法满足工业需求。

山东大学的研究团队通过系统性研究，首次在解脂耶氏酵母中建立了全面的动态启动子工具包。研究采用RNA-seq技术分析了不同生长阶段的转录组数据，结合荧光报告系统筛选，获得了116个具有不同特性的启动子元件。这些遗传工具的开发为精确调控代谢途径提供了全新可能，特别是解决了3-HP生物合成中的三大核心问题：关键酶MCR功能域表达失衡、前体丙二酰-CoA竞争性消耗，以及高代谢负荷下的前体供给不足。

关键技术方法包括：基于不同培养基(YPD/YPG)和生长阶段的转录组测序(RNA-seq)筛选候选启动子；利用eGFP报告系统定量评估启动子强度；通过截断分析和序列比对鉴定上游激活序列(UAS)；采用模块化策略组合不同特性的启动子优化3-HP合成途径。

启动子工具包的构建与表征
研究团队从基因组尺度挖掘出82个内源启动子，其强度呈现93.40倍的梯度变化。特别值得注意的是PC48和PU13两个强启动子，其活性分别达到常用启动子pTEFin的1.48倍和1.69倍。通过序列分析发现，这些强启动子含有新型上游激活序列UAS1_PC48和UAS1_PU13。此外，首次鉴定的34个生长阶段依赖性启动子，为代谢途径的动态调控提供了关键元件。

动态调控解决3-HP合成瓶颈
针对MCR酶两个功能域(MCR-C和MCR-N)表达失衡导致毒性中间体累积的问题，研究采用梯度强度启动子组合实现了精确调控。通过生长阶段下调型启动子动态控制脂肪酸合成基因FAS1的表达，有效减少了丙二酰-CoA的竞争性消耗。同时，强启动子驱动的乙酰-CoA羧化酶过表达显著提升了前体供给。这种多层次的调控策略使3-HP产量突破性地达到100.37 g/L，远超此前酵母体系的最高记录(16.23 g/L)。

工业化应用潜力
在5-L生物反应器中，工程菌株展现出0.21 g/g葡萄糖的转化率和0.48 g/L/h的生产强度。这一性能不仅创造了酵母体系的新纪录，更首次实现了与大肠杆菌等传统宿主相当的产量水平。研究特别强调，所开发的生长阶段响应型启动子无需外源诱导剂，显著降低了工业化应用成本。

这项研究的意义远超出3-HP生产本身。它首次在解脂耶氏酵母中建立了系统性的动态调控工具包，为复杂代谢途径的精确优化提供了标准化解决方案。所发现的UAS元件和启动子工程策略，可推广至其他高值化合物的生物制造。更重要的是，这项工作展示了一个普适性研究范式——通过整合组学分析与合成生物学工具开发，将非传统微生物转化为高效的细胞工厂，为可持续生物经济奠定了关键技术基础。论文的创新性成果已发表在生物工程领域顶级期刊《Bioresource Technology》上。