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本文聚焦染色质结构研究，阐述了从早期显微镜技术到冷冻电子断层扫描（cryo-ET）结合冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）技术的发展历程。介绍了这些技术在染色质结构研究中的应用、取得的成果、面临的挑战及未来展望，为深入探究染色质奥秘提供了全面视角。
染色质成像技术的演变
人类基因组包含约 32 亿个碱基对，长度达 2 米。如何将如此长的 DNA 高效包装进微小的细胞核，且在需要时能随时获取，一直是科学难题。1974 年 Kornberg 提出核小体假说，认为 DNA 缠绕在组蛋白八聚体上，这一假说后经核小体的 X 射线晶体学验证，揭示了原子层面的细节。
早期电子显微镜（EM）研究虽揭示了染色质的高阶结构，如 10nm 的 “串珠” 纤维、30nm 的单起始螺线管或双起始之字形纤维，但化学固定和重金属染色可能引入人为假象。而且，批评者认为 30nm 纤维可能是样品制备和分离的产物，因为完整的天然细胞核很少呈现出这种规律性。
冷冻电镜（cryo-EM）通过对玻璃化样品成像，减少了一些假象，但仍面临染色质异质性、样品纯化、体外重构以及完整细胞核成像等挑战。荧光显微镜则可在活细胞中实现动态、大规模的染色质可视化，如荧光原位杂交（FISH）可定位特定基因座，活细胞成像能展示染色质在有丝分裂和转录过程中的运动。然而，荧光显微镜因分辨率限制，无法解析核小体和染色质纤维的构象。因此，天然染色质纤维的结构仍不明确，亟需高分辨率的原位或细胞内成像技术。
Cryo-ET 和 Cryo-FIB：染色质成像的范式转变
Cryo-ET 是一项新兴技术，可解析大型蛋白质复合物的结构，还能可视化天然细胞环境。在 Cryo-ET 中，生物样品被快速冷冻在玻璃态冰中，以防止脱水并保持结构完整性。通过在低温透射电子显微镜（cryo-TEM）中旋转样品获取一系列倾斜投影图像，再经计算重建为断层扫描图，可在纳米甚至亚纳米分辨率下揭示大分子复合物的组织结构。
Cryo-FIB 是用于将天然生物样品（如完整细胞和组织）减薄为电子可穿透薄片的先进技术。当 Cryo-ET 与 Cryo-FIB 结合时，能在完整细胞的天然环境中对大分子进行分子层面的成像。而且，Cryo-ET 和 Cryo-FIB 的样品制备过程无需化学固定或染色，Cryo-FIB 制备的细胞薄片也不会像冷冻切片那样存在体积压缩问题。因此，近年来利用 Cryo-ET 结合 Cryo-FIB 剖析细胞内天然染色质结构引起了广泛关注。
体外冷冻电镜和冷冻电镜断层扫描研究染色质高阶结构
冷冻电镜的分辨率革命推动了利用其和冷冻电镜断层扫描在体外研究染色质高阶结构的工作。这些研究揭示了染色质的多种形式，包括短扭曲纤维、由液 - 液相分离（LLPS）形成的大凝聚物、核小体堆叠和长不规则纤维。
2014 年，对重组染色质的冷冻电镜成像确定了规则的短双起始四核小体纤维是染色质的基本结构单元。2022 年的研究表明，调节连接组蛋白 H1 的浓度可驱动染色质从孤立核小体向凝聚染色质结构域转变，凸显了 H1 在染色质组织中的关键作用。同年，对纯化端粒的冷冻电镜分析显示，染色质纤维主要由核小体堆叠和线性阵列组成，未发现扭曲双起始纤维的证据。后续对 HeLa 和 K562 细胞染色质的研究进一步证实了不规则双起始纤维可组织成连续扭曲结构。
不过，体外系统可能缺乏天然染色质调控所需的细胞因子，有引入人为假象的可能，因此需要对完整细胞核内的染色质进行研究，以阐明其生理组织形式。
冷冻聚焦离子束和冷冻电子断层扫描解析天然染色质和核小体的细胞内结构
2013 年，科学家开始利用冷冻切片的冷冻电镜断层扫描技术研究浮游生物 Ostreococcus tauri 完整细胞中的染色质结构，虽能识别出类似核小体的颗粒，但切片的体积压缩可能带来假象。
2016 年，冷冻电镜断层扫描结合冷冻聚焦离子束铣削技术的进步，使科学家能够在不产生干扰的情况下详细观察人类 HeLa 细胞的完整细胞核，清晰识别出单个核小体形成的链，为原位确定核小体结构和在染色质中定位核小体提供了可能。
2018 年，通过模板匹配和子断层图平均（STA）技术对人类 HeLa 细胞的单个核小体进行表征，获得了约 20? 分辨率的细胞内核小体结构。通过 3D 分类，可将异染色质区域的细胞内核小体分为单、双和三核小体等不同组，并进一步揭示了完整细胞核中的染色质结构域。但由于分辨率不足，追踪染色质中的每个核小体仍具有挑战性，且未观察到明显的染色质纤维。
2023 年，一项针对人类 T 淋巴母细胞核的研究利用冷冻电镜断层扫描和冷冻聚焦离子束技术，实现了细胞内核小体结构前所未有的 12? 分辨率，接近亚纳米范围。通过制备超薄薄片（<100nm），显著提高了断层扫描图的信噪比，观察到连续的染色质纤维穿过核膜附近的异染色质区域，且无需计算增强就能分辨出连接 DNA。后续的 STA 和 3D 分类确定了两种主要的单核小体群体：一种连接组蛋白 H1 与连接 DNA 结合，另一种则没有。这表明天然染色质纤维采用灵活的之字形构象，核小体连接不规则，与经典的刚性 30nm 纤维模型不同，突出了染色质的灵活性和核小体包装的异质性。
天然染色质结构的差异
冷冻电镜断层扫描的研究结果显示，不同物种的染色质结构存在显著差异，这与之前认为真核生物存在通用染色质结构的观点不符。
在酿酒酵母中，密集包装的细胞核主要由大量蛋白质复合物组成，核小体在核质中分散分布。相比之下，人类 HeLa 细胞的染色质组织成大的染色质结构域，基本不存在纤维状构象。在人类 T 淋巴母细胞中，核小体主要聚集在大的染色质结构域内，仅在核膜附近的异染色质区域观察到染色质纤维。青蛙红细胞的染色质呈现为大结构域和明显的之字形螺旋纤维。绿藻和高等植物的细胞核缺乏其他真核生物中的大分子拥挤现象，其染色质以短而离散的片段形式存在。
此外，染色质组织在细胞周期的不同阶段会动态重塑，进一步表明不存在通用的染色质结构模型。
利用细胞冷冻电镜断层扫描和冷冻聚焦离子束研究染色质的关键挑战
高分辨率解析细胞内核小体结构对理解染色质组织至关重要，但目前仍面临诸多技术障碍。
单个核小体（包括结合的 DNA）分子量约为 200kDa，去除 DNA 后，组蛋白八聚体密度低，在拥挤的核环境中难以通过目视检查或模板匹配算法检测到。与体外冷冻电镜研究相比，细胞断层扫描图的信噪比（SNR）较差，这受大分子拥挤和冷冻聚焦离子束铣削技术限制的影响。当前冷冻聚焦离子束协议制备的薄片厚度通常约为 150nm，很少低于 100nm（300keV 电子的最佳厚度），增加的厚度会导致多个核小体层重叠，降低断层扫描图质量，干扰计算识别。例如，模板匹配工作流程易因厚薄片的噪声产生误报，低信噪比和初始匹配结果不准确会导致迭代精修时核小体粒子坐标错位，阻碍染色质中核小体结构的确定。因此，具有较低系统复杂性和较高信噪比的体外冷冻电镜断层扫描在近期研究中更受青睐。
细胞内核小体的异质性也是一个挑战。体外冷冻电镜通过纯化或重构核小体，并获取数百万个粒子的图像来分类构象变异性，从而实现接近原子分辨率。而细胞冷冻电镜断层扫描缺乏这种优势，STA 优先考虑占主导地位的核小体构象，可能将少数群体视为 “垃圾” 粒子，细微构象变化的粒子可能被归为同一群体，导致许多天然核小体构象未被充分表征，降低了分辨率。而且，有限的分辨率、低信噪比和结构异质性会影响核小体在染色质中的准确映射，部分核小体粒子在模板匹配过程中被遗漏，破坏了染色质结构的整体背景。
冷冻电镜断层扫描工作流程在通量和稳定性方面也存在实际限制。样品在玻璃化、冷冻聚焦离子束铣削和薄片转移等多个阶段易出现损失和污染问题，如玻璃化时细胞分布不均和网格受损、冷冻聚焦离子束铣削时细胞薄片变形或损坏、转移时易受冰污染或薄片丢失，这些因素增加了大规模获取高质量数据集的难度。
冷冻电镜断层扫描和冷冻聚焦离子束在染色质研究中的未来展望
冷冻电镜断层扫描和冷冻聚焦离子束在染色质研究领域前景广阔。尽管面临挑战，但已有研究进展，能更详细地确定天然核小体和染色质的细胞内结构。现在已能在高质量断层扫描图中可视化核小体，并通过改进的模板匹配算法进行精确定位。冷冻聚焦离子束铣削技术也在创新，探索使用轻气体（如氩气、氙气）等离子体源替代传统镓离子，可减少表面损伤，制备更稳定、高质量的细胞薄片用于成像。
计算技术的进步，尤其是将人工智能（AI）和机器学习集成到当前冷冻电镜断层扫描和 STA 数据分析中，有望彻底改变细胞内染色质分析。这些工具可增强对密集染色质区域中单核小体的检测，减少对齐偏差，应用先进的降噪技术提高断层扫描图对比度，实现更清晰的可视化和分割。而且，断层扫描图质量的提升可大幅增加染色质中单个核小体的覆盖范围，减少结构背景信息的丢失，更精确地揭示染色质的高阶结构。同时，改进和自动化的样品制备工作流程，如不间断的冷冻聚焦离子束薄片制备和高通量冷冻电镜断层扫描结合束移采集技术，现在每天可生成数百个倾斜系列，减少了样品损失，加快了数据采集速度。
此外，冷冻相关光镜和电镜（cryo-CLEM）技术不仅可解析核小体和染色质的结构，还能可视化与不同染色质区域相关的关键转录因子以及细胞周期中的染色质重塑过程。结合体外和细胞内冷冻电镜断层扫描研究与超分辨率荧光显微镜、单粒子冷冻电镜和经典的液 - 液相分离分析，有望全面了解染色质结构，将纳米甚至亚纳米尺度的核小体细节与更大的结构域组织联系起来。除了模式细胞系，将这些技术应用于原代细胞、组织以及疾病或感染模型，将揭示不同生物学背景下染色质的变异性。目前，在完整细胞核的断层扫描图中经常观察到核凝聚物（如核仁），但染色质与核凝聚物之间的相互作用仍是新兴研究领域，未来冷冻电镜断层扫描研究有望阐明相分离如何在完整细胞中调控染色质动态和基因表达。
总之，冷冻电镜断层扫描已成为关键工具，克服了传统电镜的假象和荧光显微镜的分辨率限制，揭示了染色质在天然细胞核中与功能状态紧密相关的灵活且相分离的结构。随着冷冻电镜断层扫描和冷冻聚焦离子束技术的不断发展，它们在解读染色质物理结构如何编码基因组逻辑方面具有巨大潜力，将重塑我们对表观遗传学、细胞周期调控、病毒感染和疾病机制的理解，开启结构生物学的新时代。
