基于纳米孔测序的支气管肺泡灌洗液病原体宏基因组三代测序技术优化与临床验证研究

为解决肺炎病原体快速精准诊断难题，浙江大学医学院团队通过优化mTGS(宏基因组三代测序)关键技术参数（细胞壁裂解、片段选择、宿主DNA去除等），在313例肺炎患者BALF样本中验证显示：优化后mTGS灵敏度较传统方法提升45.3%，与mNGS(二代测序)相当(84.7% vs 79.9%)，为呼吸道感染病原诊断提供新方案。

　　

肺炎作为全球感染性疾病致死首要原因，其病原学诊断的延迟会导致广谱抗生素滥用、住院时间延长等系列问题。传统微生物培养方法检出率不足30%且耗时超48小时，而PCR等分子检测又存在靶标范围狭窄的局限。虽然宏基因组二代测序(mNGS)能实现广谱病原检测，但其短读长(50-100bp)、高成本等缺陷限制了临床应用。相比之下，基于纳米孔技术的三代测序(mTGS)具有长读长、实时分析等优势，但缺乏标准化技术方案和质量控制体系。

浙江大学医学院附属第一医院团队在《eBioMedicine》发表的研究，通过优化细胞壁裂解条件(三维高速振动+溶菌酶100℃裂解)、片段选择策略(末端+切口修复酶)、取消宿主DNA去除、确定800MB测序深度等关键技术参数，建立了标准化mTGS检测流程。研究采用阶梯式验证策略：先用13种微生物参考样本优化技术参数，再通过8例肺炎患者BALF样本预实验，最终在313例多中心前瞻性队列（来自浙江省7家医院）中与常规微生物检测(CMTs)、mNGS进行平行比对。

优化mTGS实验流程
通过改进细胞壁裂解条件，使结核分枝杆菌(M. tuberculosis)和新生隐球菌(C. neoformans)等厚壁微生物检测灵敏度提升10倍；优化片段选择策略使平均读长增至1000bp，显著提升病毒基因组检出率；临床样本验证发现800MB测序深度即可达到检测平台期。

临床验证结果
在274例确诊肺炎患者中，mTGS共检出376种病原体，灵敏度显著高于CMTs(84.7% vs 39.4%)，与mNGS相当(84.7% vs 79.9%)。其中对M. tuberculosis、鹦鹉热衣原体(C. psittaci)等检出优势明显，而mNGS对非结核分枝杆菌(NTM)、耶氏肺孢子菌(P. jirovecii)更敏感。诊断符合率达81.8%，阴性预测值提升至40%。

该研究首次系统建立了肺炎BALF样本的mTGS标准化检测体系，证实其与mNGS相当的临床诊断效能。技术创新点包括：首创"物理振动+酶解"双模式裂解技术，突破厚壁微生物检测瓶颈；通过片段修复策略解决病毒小基因组易丢失难题；明确800MB测序深度为性价比最优方案。值得注意的是，取消宿主DNA去除的策略虽降低特异性(71.8% vs 92.3%)，但显著提高了低载量病原体检出率。

研究者指出，mTGS单样本检测成本已降至约800元人民币，测序时间短于2小时，具有临床转化优势。未来需在免疫缺陷人群、儿童等更复杂队列中验证，并拓展至血液、脑脊液等样本类型。该技术为呼吸道感染病原诊断提供了更快速、经济的解决方案，对指导精准抗感染治疗具有重要意义。