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核桃蛋白（WP）营养丰富、功能优良，但传统碱提等电沉淀法（AE-IP）提取存在诸多弊端。研究人员采用甜菜碱 - 尿素 / K?HPO?组成的低共熔溶剂双水相体系（DES-ATPS）提取 WP，发现该法可提升蛋白纯度和色泽，且对蛋白结构和功能影响独特。此研究为 WP 绿色高效提取提供新思路。
在食品科学的广阔天地里，核桃蛋白（WP）凭借着高营养价值和出色的技术功能特性，吸引着众多科研人员的目光。它含有丰富的必需氨基酸，在烘焙、核桃奶等食品领域大显身手。然而，传统的提取方法 —— 碱提等电沉淀法（AE-IP）却像是一位 “拖后腿” 的队友。这种方法通常从核桃油生产后的残渣核桃粕中提取 WP，在高温、高压、有机溶剂以及强碱性环境下进行。这样的条件就像一场 “破坏风暴”，会打乱 WP 的天然结构，让蛋白质变性，不仅影响其功能特性，还可能限制它在食品工业中的广泛应用。而且，AE-IP 方法耗时又费力，就像一个低效的 “生产机器”。为了突破这些困境，寻找更绿色、高效的提取方法，来自国内的研究人员踏上了探索之旅。他们开展了利用甜菜碱 - 尿素 / K?HPO?双水相体系（DES-ATPS）提取核桃蛋白的研究，并将成果发表在《Food Chemistry: X》上。
研究人员为了深入探究这种新提取方法的效果，采用了一系列关键技术方法。在提取过程中，通过优化温度、时间、料液比和盐浓度等条件来提高提取效率。利用 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析蛋白亚基组成，通过表面疏水性（H?）、内在荧光光谱、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）等技术研究蛋白结构特性，运用氨基酸分析仪测定氨基酸组成，还通过测定水溶解性、乳化活性和稳定性、发泡活性和稳定性等评估蛋白功能特性。
提取条件对 WP 提取效果的影响
研究人员首先对提取条件进行优化。温度方面，当温度从 40°C 升高到 55°C 时，蛋白得率从 41.51% 升至 56.50%，这是因为温度升高降低了甜菜碱 - 尿素体系的黏度，增加了扩散力和蛋白溶解速率。但温度进一步升高到 60°C 时，得率下降，因为过高温度会破坏蛋白与水分子间的氢键，还可能导致蛋白结构改变。提取时间上，随着时间增加，蛋白得率逐渐上升，120 分钟后增加不再显著，且过长时间会使蛋白分子表面疏水基团暴露，导致部分聚集，所以 120 分钟为最佳提取时间。固体 / 液体比从 1:10 增加到 1:25 时，蛋白得率显著提高，这得益于核桃粕与 DES 接触面积增大，传质效率提升。但继续增加固液比，蛋白得率反而下降。盐浓度在小于 0.6% 时，随着浓度增加，蛋白得率升高，达到 0.6% 时得率最高，超过这个浓度，得率又降低。在最优条件下，采用 DES-ATPS 提取 WP，提取率可达 64.21%，尿素残留量为 0.278mg/kg 。
WP 的基本组成和比色分析
研究发现，DES-ATPS 法的提取效率显著高于 AE-IP 法。D-WPI 和 DM-WPI 的纯度分别达到 93.34% 和 91.22%，远高于 AE-IP 法提取的蛋白纯度。AE-IP 法提取的 WP 水分含量较高，灰分含量也显著高于 DES-ATPS 法提取的样品。颜色方面，D-WPI 颜色更白，L值最高，其他样品则偏淡黄色，a值较高。这是因为碱性和高温条件下，AE-IP 法提取的蛋白易发生美拉德反应，影响色泽和营养价值。而且，不同方法提取的 WP 在质地和微观结构上也存在差异。
WP 的结构特性
在结构特性研究中，SDS-PAGE 分析显示，DES-ATPS 和 AE-IP 法提取的 WP 亚基组成没有显著差异。但在表面疏水性（H?）上，AE-IP 法提取的蛋白 H?值较高，而 DES-ATPS 法提取的蛋白 H?值较低，这与 AE-IP 法中高 pH 环境促使疏水基团暴露有关。内在荧光光谱表明，两种方法提取的 WP 构象存在差异，DES-ATPS 法提取的蛋白色氨酸残基更暴露于亲水环境。FT-IR 光谱分析发现，两种提取方法对蛋白分子内肽键的影响相似，但 DES-ATPS 法能更有效地保留 WP 的 α- 螺旋结构，使 D-WPI 和 DM-WPI 的 α- 螺旋含量增加，β- 折叠含量减少，随机卷曲含量增加，β- 转角减少。Zeta 电位和粒径分析显示，AE-IP 法提取的蛋白 Zeta 电位值更高，粒径更小；DES-ATPS 法提取的蛋白 Zeta 电位值较低，粒径较大且呈聚集状态 。氨基酸分析表明，WP 含有 16 种氨基酸，必需氨基酸含量高，两种方法提取的 WP 亲水氨基酸残基比例相似，但总氨基酸含量存在差异。
WP 的功能特性
功能特性研究结果表明，在中性条件下，AE-IP 法提取的 WP 水溶性更好，这与蛋白部分展开、粒径较小以及表面电荷较高有关。但在 pH 为 2.0 和 11.0 时，DES-ATPS 法提取的 D-WPI 和 DM-WPI 溶解度更高。乳化活性和稳定性方面，AE-IP 法提取的 WP 表现更优，这是因为其蛋白展开程度高，疏水基团暴露多，能降低油水界面张力。发泡活性和稳定性上，AM-WPI 表现最佳，D-WPI 最差，且发泡性能与 WP 的水溶性呈正相关。
研究结论和讨论部分指出，利用 DES-ATPS 提取核桃蛋白是一种环保、实用的方法，无需调节 pH 值。该方法提高了核桃蛋白的纯度和提取率，改善了颜色特性，保留了完整的蛋白亚基。虽然在中性条件下，DES-ATPS 法提取的核桃蛋白在水溶性、乳化性和发泡性方面相对较弱，但在酸性条件下（pH 2），D-WPI 和 DM-WPI 的溶解度显著提高。这项研究为核桃蛋白的绿色高效提取提供了新的思路和方法，有助于推动核桃蛋白在食品工业中的进一步应用，为食品科学领域的发展注入了新的活力。
