探秘骨髓增殖性肿瘤：I 型和 II 型钙网蛋白（CALR）突变对 mTORC2 信号通路的差异化调控意义非凡

在骨髓增殖性肿瘤（MPN）研究中，为明确 I 型和 II 型钙网蛋白（CALR）突变在信号通路中的差异，研究人员开展相关研究。结果发现二者对 mTORC2 信号通路调控不同，这为理解 MPN 发病机制及靶向治疗提供方向。

　　在医学研究的神秘世界里，有一种名为骨髓增殖性肿瘤（MPN）的疾病一直困扰着科学家们。MPN 患者体内血小板计数会异常增加，而这背后的 “元凶” 之一就是钙网蛋白（CALR）的突变。CALR 本是内质网中一位勤勤恳恳的 “小助手”，作为分子伴侣帮助新生多肽正确折叠，维持细胞内环境的稳定。但当它发生突变时，就像是被 “黑化” 了一样，开始捣乱。

CALR 的突变主要分为 I 型和 II 型，这些突变都发生在其最后一个外显子上，导致它失去了原本的负电荷尾巴和内质网的检索序列（KDEL）。这两种突变虽然都能激活血小板生成素受体（TpoR），促使血小板大量生成，但奇怪的是，它们在患者身上却表现出不同的疾病特征。I 型突变与骨髓纤维化关系密切，而 II 型突变的患者发病年龄更小，病情也更为凶猛。

科学家们一直想弄清楚，这两种突变在分子机制层面到底有什么不同呢？为了解开这个谜团，印度理工学院德里分校 Kusuma 生物科学学院的研究人员展开了一场精彩的科研之旅。他们的研究成果发表在《Cell Communication and Signaling》杂志上，为我们理解 MPN 的发病机制打开了一扇新的大门。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是细胞培养和转染技术，培养了 Ba/F3、K562、HEK293 和 U2OS 等多种细胞系，并将不同的 CALR 质粒转染到细胞中；二是免疫印迹技术，用于检测细胞内蛋白质的表达和磷酸化水平；三是染色质免疫沉淀（ChIP）结合 qPCR 技术，探究 CALR 蛋白与基因调控区域的结合情况；四是葡萄糖摄取和 ATP 测量实验，研究细胞的代谢变化。

研究结果

1. I 型和 II 型 CALR 突变对 mTORC2 活性的差异化调节：研究人员在 HEK293 细胞中过表达 HA 标记的 CALR 野生型（WT）、Δ52（I 型）和 ins5（II 型），检测 mTORC1 和 mTORC2 的基础激活情况。结果发现，与 CALR WT 相比，表达 CALR Δ52 的细胞中，mTORC2 特异性的 mTOR S²⁴⁸¹及其下游效应蛋白 Akt S⁴⁷³、NDRG1 T³⁴⁶的磷酸化水平下降；而 CALR ins5 则表现出这些蛋白磷酸化水平的上升。但两种突变对 mTORC1 的 S²⁴⁴⁸和 Akt T³⁰⁸的磷酸化没有影响，这表明 I 型和 II 型 CALR 突变能差异化地调节 mTORC2 活性。
2. CALR WT 截短突变对 mTOR 活性的影响：研究人员构建了 CALR WT 的截短突变体（CALR WT Δ15、Δ30、Δ45 和 ΔExon9）。结果发现，随着 CALR WT 尾巴的逐步截短，mTOR S²⁴⁸¹和 mTOR S²⁴⁴⁸的磷酸化水平逐渐增加，Akt S⁴⁷³的磷酸化也相应增加，而 Akt T³⁰⁸的磷酸化不变。这说明 CALR WT 尾巴的截短可以激活 mTORC2，但 CALR Δ52 却异常下调 mTORC2 活性，这是 I 型和 II 型突变的一个关键差异。
3. c-JUN 通过 RICTOR 下调 CALR I 型突变中的 mTORC2 活性：研究人员发现，在表达 CALR Δ52 的细胞中，c-JUN 表达升高，同时 RICTOR 表达降低。过表达 c-JUN 会导致 RICTOR 表达下降，mTORC2（S²⁴⁸¹）和 Akt S⁴⁷³磷酸化减少；而用 siRNA 沉默 c-JUN，则能逆转 CALR Δ52 对 mTORC2 磷酸化及其下游靶点 Akt S⁴⁷³的抑制作用。此外，单独过表达 RICTOR 或 mSIN1 不能完全恢复 mTORC2 活性，同时过表达二者才能有效恢复，这表明 I 型 CALR 突变细胞中 mTORC2 组装受损。
4. CALR Δ52 占据 jun 的远端增强子：通过染色质免疫沉淀（ChIP）实验，研究人员发现 CALR Δ52 在 jun 的远端增强子区域 2 和 3 有显著富集，而 CALR WT 和 ins5 没有明显富集。这就解释了为什么 CALR Δ52 能增强 c-JUN 的表达，原来是它直接结合到了 jun 的远端增强子上。
5. I 型和 II 型 CALR 突变对 Akt 抑制剂的敏感性：研究人员用 MK2206、GDC0068 和 GSK2334470 等 Akt 抑制剂处理表达不同 CALR 的细胞，发现这些抑制剂都能抑制 mTORC1 和 mTORC2 的活性。虽然 GDC0068 会使 AKT S⁴⁷³和 T³⁰⁸磷酸化增加，但不影响其对 mTOR 信号通路的抑制作用，这说明 I 型和 II 型 CALR 突变对 PDK1 和 Akt 抑制剂都敏感。
6. c-JUN 下调 I 型 CALR 突变中的葡萄糖摄取：由于 mTORC2 参与葡萄糖代谢，研究人员检测了细胞的葡萄糖摄取情况。结果显示，CALR Δ52 细胞的葡萄糖摄取明显低于 CALR WT 细胞，而 CALR ins5 细胞的葡萄糖摄取和 ATP 水平则高于 CALR WT 和 CALR Δ52 细胞。过表达 RICTOR 或 mSIN1，或者同时过表达二者，都能增加 CALR Δ52 细胞的葡萄糖摄取和 ATP 水平。敲低 c-JUN 也能显著提高 CALR Δ52 细胞的葡萄糖摄取，这表明 c-JUN - mTORC2 - Akt S⁴⁷³轴在调节细胞葡萄糖摄取和能量代谢中起着重要作用。
7. c-JUN - mTORC2 - AKT 轴在 MPN 细胞系模型中的保守性：在 Ba/F3 和 K562 细胞系中，表达 CALR Δ52 的细胞同样表现出 mTORC2（S²⁴⁸¹）特异性磷酸化和 Akt S⁴⁷³磷酸化降低，c-JUN 表达升高，以及葡萄糖摄取减少的现象，这进一步证实了 c-JUN - mTORC2 - AKT 轴在不同 MPN 细胞系模型中的保守性。

研究结论与讨论

这项研究首次揭示了 I 型和 II 型 CALR 突变在调节 mTORC2 信号通路上的关键差异。I 型突变（CALR Δ52）通过结合 jun 的远端增强子，增加 c-JUN 的表达，进而下调 RICTOR 的表达，抑制 mTORC2 活性，最终导致葡萄糖摄取和细胞 ATP 水平下降；而 II 型突变（CALR ins5）则表现出相反的效果，能增强 mTORC2 活性和葡萄糖摄取。

这一发现意义重大。一方面，它加深了我们对 CALR 突变驱动的 MPN 发病机制的理解，为我们揭示了隐藏在疾病背后的分子奥秘；另一方面，它为开发针对 MPN 的靶向治疗策略提供了新的潜在靶点。既然 I 型和 II 型 CALR 突变对 Akt 抑制剂都敏感，那么以 Akt 抑制为基础的治疗策略或许能为 MPN 患者带来新的希望。同时，c-JUN - mTORC2 - Akt S⁴⁷³轴也可能成为未来药物研发的重要方向，有望开发出更精准、更有效的治疗 MPN 的药物，为患者的健康保驾护航。