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微生物油脂提取面临难题，研究人员以圆红冬孢酵母（Rhodotorula toruloides）为对象，用 MTBE 和正己烷二元溶剂提取脂质。该方法在 60% 脂质提取率下保持 5% 细胞存活率，实现细胞循环利用，为微生物脂质生产降本提供新途径。
在生物能源和化学品生产领域，微生物油脂的提取至关重要。油脂微生物，如特定的酵母、细菌和藻类，能生产单细胞油（SCO），广泛应用于生物燃料、制药等行业。圆红冬孢酵母（
Rhodotorula toruloides）因底物利用广泛、抗逆性强和脂质产量高，成为生产脂质和其他有价值化学品的理想菌株。然而，其独特的细胞结构却给脂质提取带来了巨大挑战。微生物细胞体积微小，传统机械压榨方法难以获取胞内脂质。而且，像圆红冬孢酵母这类油脂酵母的细胞壁富含几丁质和甘露聚糖，具有高强度、厚度和密度，使得脂质提取困难重重。当前的提取技术，要么在预处理过程中耗能巨大，还会引入杂质；要么成本高昂，不利于大规模应用。因此，开发高效、环保且经济的脂质提取方法迫在眉睫。
为了解决这些问题，中国科学院大连化学物理研究所等机构的研究人员开展了一项关于从圆红冬孢酵母发酵液中提取细胞内脂质的研究。研究发现，在温和条件下，MTBE（甲基叔丁基醚）和正己烷的混合溶剂能有效从圆红冬孢酵母发酵液中直接提取脂质，无需破坏细胞结构。该方法实现了 60% 的脂质提取率，同时还能维持 5% 的细胞存活率。存活的细胞在补充新鲜碳源和氮源后可以重新生长并产生脂质，从而实现了脂质提取和细胞再生的循环过程。这一研究成果发表在《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》上，为同时进行发酵和脂质提取的工艺优化和规模化生产提供了有前景的基础。
研究人员开展研究时用到的几个主要关键技术方法如下：
- 脂质提取方法：采用酸 - 加热提取（AHE）法作为测定总脂质含量的标准方法；同时使用 MTBE 和正己烷的二元溶剂体系进行脂质提取实验，并优化其条件12。
- 分析方法：运用干重法测定细胞质量，通过生物传感分析仪测量培养液中的葡萄糖含量，利用紫外 - 可见分光光度计测定 OD600值；借助气相色谱 - 质谱联用仪（GC - MS）分析脂质的脂肪酸组成；采用尼罗红（Nile red）染色观察细胞内脂滴，用碘化丙啶（PI）染色评估细胞存活情况和细胞膜完整性，还运用划线平板法和涂布平板法评估细胞活力345。
下面介绍研究的具体结果：
- 溶剂处理对圆红冬孢酵母的结果及机制：通过用不同溶剂处理圆红冬孢酵母细胞并染色观察发现，乙醇、MTBE 和氯仿处理的细胞被 PI 染色，表明细胞死亡；而正己烷处理的细胞仍保持活力。氯仿的脂质提取效率显著，但会使细胞内脂滴几乎消失；正己烷虽能保持细胞活力，但难以穿透细胞膜提取胞内脂质。不同溶剂的提取机制与其溶解性和极性相关，极性溶剂主要阻力是脂质溶解，弱极性溶剂可溶解细胞膜和胞内脂质，非极性溶剂则受细胞结构中多种成分阻碍难以有效提取脂质678。
- 探索平衡脂质回收和细胞活力的脂质提取方法：以不同培养时间的圆红冬孢酵母发酵液为材料，用不同比例的 MTBE / 正己烷二元溶剂进行提取实验。结果显示，除培养 24h 的发酵液外，48 - 120h 发酵液的脂质提取能力受 MTBE 比例显著影响，MTBE 比例增加，提取能力增强；培养时间延长，细胞内油脂含量上升，脂质提取效率也显著提高。综合考虑，确定 40% MTBE 的二元溶剂为最佳比例，此时部分细胞在提取后仍能存活，细胞存活率为 5.34%。添加 MTBE 形成的二元溶剂提取的脂质脂肪酸组成与 AHE 法相近91011。
- 脂质提取后存活细胞的回收利用：在脂质提取后的圆红冬孢酵母培养液中添加碳源，设计新的脂质生产过程。研究发现，在氮限制（Nl）和富氮（Nr）条件下，回收的培养液中的细胞均可重新生长和利用葡萄糖生产脂质。虽然 Nr 条件下细胞生长和葡萄糖消耗更快，但最终脂质产量低于 Nl 条件。该研究实现了培养液（包括细胞）的大部分回收再利用，为微生物脂质技术中的废水、营养物质和细胞质量的回收提供了更高效的过程121314。
研究结论和讨论部分表明，该研究开发的 MTBE 和正己烷二元溶剂提取方法具有诸多优势。它避免了传统方法中破坏细胞壁所需的高能耗热化学处理，减少了废弃物的产生，实现了发酵液和溶剂的循环利用，还支持半连续脂质生产。尽管 5% 的活细胞回收率和 60% 的提取率可能在生物柴油生产中经济优势不明显，但存活细胞可用于原位进一步发酵，无需分离。死亡细胞可被水解酶分解，为活细胞生长提供营养。这一研究为未来微生物脂质生产的连续操作提供了新的思路，为同时进行发酵和脂质提取过程的进一步优化和规模化提供了有希望的基础，在微生物油脂生产领域具有重要的理论和实践意义。
