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为探究环状 RNA（circRNAs）的调控机制，华中农业大学研究人员开展了 circRNAs 相关研究。通过多细胞系转录组分析，发现 PTBP1 是 circRNA 生物发生的关键调节因子，且在急性髓系白血病（AML）中与 circRNAs 共上调，或为白血病治疗提供新靶点。
在生命的微观世界里，RNA 分子一直是科学家们重点关注的对象。环状 RNA（circRNAs）作为一类非编码 RNA，犹如隐藏在细胞深处的神秘宝藏，吸引着众多科研人员去探索。circRNAs 通过特殊的反向剪接（back splicing）过程产生，形成稳定的共价闭合结构，它们广泛存在于细胞质或外泌体中，具有组织特异性、疾病特异性以及高稳定性等特点 。然而，尽管 circRNAs 在众多细胞生物学过程中发挥着重要作用，比如作为微小 RNA（miRNA）海绵调控靶基因表达，但它们的调控因子却一直未被完全揭示，这就如同在黑暗中摸索，不知道方向在哪里。
为了揭开 circRNAs 调控机制的神秘面纱，华中农业大学的研究人员勇敢地踏上了探索之旅。他们开展了一项极具意义的研究，旨在找出调控 circRNA 生物发生的关键因子，并深入探究其潜在机制以及在疾病中的作用。最终，他们取得了一系列令人瞩目的成果，相关论文发表在《BMC Biology》上。
研究人员为开展此项研究，运用了多种关键技术方法。他们收集了 10 种细胞系的公共转录组数据集进行分析，同时构建了细胞模型，如对 K562 细胞进行 PTBP1 基因敲低（knockdown）处理。在检测分析方面，使用了 RNA 测序（RNA-seq）、circRNA 测序（circRNA-seq）、RNA 免疫沉淀测序（RIP-seq）等技术，还通过构建 ceRNA 网络、进行基因功能富集分析等方法，全面深入地挖掘数据背后的生物学意义。此外，研究中使用的临床样本数据来源于 GEO 数据库中的急性髓系白血病（AML）样本。
下面让我们来详细了解一下研究的具体结果：
- PTBP1 被确定为调控 circRNAs 的关键 RBP：研究人员分析 10 种细胞系的 circRNAs 后发现，circRNA 表达具有明显的细胞特异性，超过 25% 的 circRNAs 仅在单个细胞系中表达。通过构建 circRNA 共表达网络，发现该网络能有效区分不同细胞类型。进一步分析 RNA 结合蛋白（RBPs）的基序（motifs），发现 PTBP1 和 HNRNPL 在具有最多基序的前 8 个 RBPs 中表达水平最高。鉴于 HNRNPL 对 circRNA 生物发生的调控作用已有报道，研究人员将重点聚焦于 PTBP1。分析还发现，含有 PTBP1 基序的 circRNAs 侧翼内含子明显更长，且 circRNAs 与 PTBP1 的表达水平呈显著正相关 ，这表明 PTBP1 可能在调控 circRNA 水平中发挥关键作用。
- 敲低 PTBP1 降低 K562 细胞中 circRNA 水平并影响细胞增殖：在 K562 细胞系中敲低 PTBP1 后进行 circRNA-seq 分析，发现敲低组的 circRNA 数量和表达水平均显著下降，且这种调控与线性转录本的剪接过程无关。通过实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）验证了部分差异表达的 circRNAs 及其相应线性转录本。此外，敲低 PTBP1 后 K562 细胞的增殖能力急剧下降，说明 PTBP1 对细胞增殖可能至关重要。
- PTBP1 对 circRNAs 的调控具有细胞类型特异性：分析 CD34+细胞和 HeLa 细胞在 PTBP1 敲低后的 circRNA 表达情况，发现 CD34+细胞中 circRNA 表达变化不大，而 HeLa 细胞中 circRNA 丰度显著上调，但相应线性转录本丰度下降。这表明 PTBP1 对 circRNA 生物发生的调控作用具有细胞特异性。
- circSPPL3 被鉴定为 PTBP1 的靶标：在两个 PTBP1 敲低组中，circSPPL3 不仅具有较高的连接比率排名，而且表达下降最为显著。对 circSPPL3 进行生物学鉴定，证实其来源于 SPPL3 基因外显子 4 - 6 的反向剪接，且对 RNase R 核酸外切酶具有耐受性。
- PTBP1 通过识别侧翼内含子基序调控 circSPPL3 的反向剪接：RIP-seq 分析显示 PTBP1 主要结合内含子和启动子区域，其结合基序主要为 UC 重复序列。在差异表达的 circRNAs 中，PTBP1 的结合主要富集在反向剪接位点附近的内含子区域。构建 minigene 报告基因系统发现，破坏 PTBP1 在 circSPPL3 内含子两侧的结合位点会抑制其调控作用。
- 侧翼内含子中 PTBP1 结合位点促进 circRNA 生物发生：利用 miniGFP 模型，在其上游和下游插入 UYYY 基序序列后发现，只有当 PTBP1 结合位点同时存在于 circRNA 位点两侧时，才能有效促进 circRNA 生物发生。
- PTBP1 与 circRNAs 在 AML 中同时上调：分析 AML 临床样本数据发现，AML 患者中 PTBP1 和 circRNA 的表达水平均显著高于健康样本。PTBP1 高表达的 AML 患者生存率较低，且 circSPPL3 在 AML 中的表达也显著上调，提示 PTBP1 可能影响 AML 细胞中 circRNA 的生物发生。
- PTBP1 可能通过调控 circRNAs 影响 AML 细胞增殖：通过基因集富集分析（GSEA）发现，AML 中差异表达的基因参与内皮细胞增殖、迁移和 mRNA 剪接等过程。构建 ceRNA 网络并分析发现，PTBP1 相关的 circRNAs 可能通过调控靶基因参与细胞增殖相关的生物学过程，如 B 细胞增殖、MAP 激酶活性等，且涉及多个与细胞增殖相关的信号通路，如 FoxO、MAPK、Rap1、Ras 和 TGF-β 信号通路。在细胞增殖相关的 ceRNA 网络中，还鉴定出了 6 个潜在的 hub circRNAs，提示 PTBP1 可能通过调节这些 circRNAs 的表达影响 AML 细胞增殖。
在讨论部分，研究人员指出，PTBP1 对 circRNA 生物发生的调控机制此前未被报道，他们的研究表明这种调控与线性转录本剪接无关。虽然 circRNA 的鉴定存在挑战，但研究中通过多种方法尽量减少误差。此外，在白血病中，基因剪接异常常见，PTBP1 和 circRNA 在 AML 中的异常表达及与患者预后的关系，提示它们在白血病进展中的潜在作用，不过仍需进一步实验验证。
综上所述，该研究首次证实 PTBP1 是 circRNA 生物发生的关键调节因子，揭示了其在急性髓系白血病中与 circRNA 表达的潜在关联。这一发现为深入理解 circRNA 的调控机制提供了新的视角，也为白血病的治疗提供了潜在的新靶点，有望为攻克白血病这一难题带来新的曙光。
