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为解决对农杆菌介导的 T-DNA 在单个植物细胞中表达缺乏定量和预测性理解的问题，研究人员开展了农杆菌 T-DNA 表达定量剖析研究。结果发现细菌间存在密度依赖的协同和拮抗作用，还开发了 “BiBi” 系统。这为植物生物学研究和工程应用提供新视角。
在植物生物技术的发展进程中，农杆菌介导的基因转移（Agrobacterium - mediated gene transfer）堪称基石。借助农杆菌将 T-DNA（Transfer - DNA） 转移到植物细胞的细胞核，这一技术开启了植物生物技术的新时代。比如，通过农杆菌浸润法（agroinfiltration），能在烟草叶片中瞬时表达 T-DNA，快速重建复杂的代谢途径和合成基因电路。此外，利用携带大量基因文库的农杆菌，结合下一代测序技术，可并行表征植物 DNA 调控区域。
然而，随着相关应用日益复杂，现有认知的短板逐渐暴露。尽管农杆菌介导的基因转移在基础和应用植物生物学中占据关键地位，但人们对这一过程的理解大多停留在定性层面。在描述农杆菌感染单个植物细胞时，经典的泊松模型（Poisson model）是否适用尚不明确。而且，缺乏理论框架来模拟 T-DNA 在单个植物细胞中的表达，这使得优化和解释相关实验变得困难重重。为了填补这些知识空白，来自美国联合生物能源研究所（Joint BioEnergy Institute）、劳伦斯伯克利国家实验室（Lawrence Berkeley National Laboratory）等机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Nature Plants》上，为植物基因工程领域带来了新的曙光。
研究人员运用了多种关键技术方法。在检测方面，利用活荧光显微镜（live fluorescence microscopy）结合基因编码的荧光报告基因，对感染的植物细胞进行无创追踪，从而量化被感染的植物细胞数量。通过荧光酶标仪测定（fluorescence plate reader assay），快速检测叶片组织水平的荧光，以此评估不同菌株组合的相互作用。此外，还采用了免疫启动测定（immune priming assay）和发光测定（luminescence assay）来研究植物的免疫反应。在模型构建方面，运用数学建模（mathematical modelling）的方法，结合实验数据，深入剖析农杆菌致病机制以及 T-DNA 的表达规律。
研究结果
- 转化不符合泊松分布：研究人员首先对转化过程是否符合随机过程进行探究，以泊松分布模型为基础进行测试。他们构建了携带荧光报告基因的农杆菌菌株，包括绿色荧光蛋白（sfGFP）和红色荧光蛋白（mCherry）标记的菌株，并创建了稳定表达核定位蓝色荧光蛋白（BFP）的转基因烟草品系。实验结果显示，虽然在给定总 OD（optical density，光密度）下，农杆菌浸润可近似看作泊松过程，但转化效率并非恒定，而是与细菌总密度呈负相关。这意味着浸润的细菌会相互拮抗彼此的转化效率，与泊松模型的关键假设相矛盾。不过，在给定总 OD 时，转化仍可被视为随机过程。
- 改进的转化模型：基于上述发现，研究人员进一步探究，发现拮抗作用可看作模型中的 “隐藏变量”，它会降低单个细菌的转化效率。通过将总 OD 作为变量纳入方程，他们得到了拮抗校正参数，并创建了 “有效 OD（ODeff）” 的概念。利用ODeff，可以将不同总 OD 下的曲线合并为一条 “主” 泊松曲线，从而校正拮抗作用的影响，得到更准确的模型。
- 拮抗作用的基础研究：研究人员推测，拮抗作用可能发生在 T-DNA 传递的上游或下游。通过实验发现，使用不同启动子驱动的 GFP 报告菌株滴定实验中，组织水平的 GFP 表达在 OD 约为 0.4 时达到饱和，且饱和现象并非由植物基因表达资源耗尽所致。同时，使用不同菌株进行实验表明，拮抗作用发生在转化上游，即植物细胞外的质外体空间。进一步探索质外体拮抗的基础，研究人员考虑了空间竞争、代谢竞争和植物免疫诱导三种可能的情况。通过基因敲除实验发现，空间竞争并非拮抗作用的主要原因；补充氨基酸、微量元素或维生素等代谢物实验表明，代谢竞争也不太可能是拮抗作用的根源；而免疫启动测定和发光测定结果显示，农杆菌可触发植物的免疫反应，且这种反应与细菌密度相关，这表明质外体拮抗可能源于细菌群体触发的植物免疫反应。
- 携带 pTi 菌株的协同 T-DNA 表达：研究发现，添加低 OD 的空载体菌株（EV）可增加报告菌株驱动的组织水平 GFP 荧光，这种现象被称为细菌在 T-DNA 表达中的协同作用。研究表明，T-DNA 和 pTi 对于协同作用都是必需的，且在低细菌密度下，携带 pTi 的菌株可协同提高宿主细胞中 T-DNA 编码基因的表达；而在高细菌密度下，拮抗作用超过协同作用。进一步研究发现，协同作用并非源于转化效率的提高，而是源于已转化细胞中 T-DNA 表达的增加，且这种协同作用依赖于 pTi 编码的效应蛋白的分泌，尤其是 VirE2 蛋白。
- 携带双质粒菌株绕过拮抗限制：由于拮抗作用限制了每个细胞中可共表达的转基因多样性，研究人员构建了携带两个二元载体的菌株（“BiBi” 菌株）。实验表明，BiBi 菌株可增加单位 OD 下表达多个 T-DNA 的细胞比例。通过开发数学模型，研究人员深入理解了 BiBi 菌株中 T-DNA 的表达过程，并预测在表达多个转基因时，BiBi 菌株比常规菌株更具优势。
- BiBi 菌株用于复杂代谢工程：研究人员以 14 基因的萝卜硫苷（glucoraphanin）生物合成途径为例，测试 BiBi 系统在复杂代谢工程中的应用。实验结果显示，在低 OD 下，BiBi 菌株组合比 14 个单质粒菌株组合能更有效地促进萝卜硫苷的合成，这与理论预测相符。在高 OD 下，虽然 BiBi 菌株的优势不如低 OD 时明显，但仍可观察到其促进作用，不过可能受到代谢途径非线性效应的影响。
研究结论表明，本研究建立了目前最全面的在细胞水平模拟转基因表达的框架，发现了农杆菌致病机制中此前未被充分认识的方面，如质外体拮抗、协同 T-DNA 表达以及 BiBi 菌株中两步随机 T-DNA 传递。这些发现不仅适用于农杆菌，还揭示了适用于其他细菌病原体的原理。在应用方面，BiBi 菌株可用于增加共表达转基因的多样性，为植物代谢工程和生物技术应用提供了新的策略和方法。这一研究成果为植物生物学的基础研究和实际应用开辟了新的道路，有望推动相关领域取得更多突破。
