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在酶催化研究中，水与酶催化机制的关联尚不明确。研究人员聚焦碳酸酐酶 II（CAII），运用紫外线（UV）光解技术结合控温 X 射线晶体学开展研究。结果揭示了 CAII 催化机制及活性位点水的结构和动力学，为理解酶催化提供新视角。
在生命的微观世界里，酶作为生物化学反应的 “超级催化剂”，能够让反应速率大幅提升，可比单纯在水溶液中的反应快上
1019倍。而水，这个在生命活动中无处不在的物质，在酶的结构稳定和催化过程中扮演着至关重要的角色。然而，尽管大家都知道水很重要，但对于水的结构和动力学如何与酶的催化机制紧密相连，比如底物结合、过渡态稳定和产物释放等过程，却知之甚少。尤其是在分子层面，将快速的水动力学（亚纳秒范围）与酶催化联系起来的详细信息更是稀缺，这就像在黑暗中摸索，难以看清酶催化过程的完整面貌。
为了揭开这个神秘的面纱，来自韩国蔚山科学技术院（Ulsan National Institute of Science and Technology）等多个机构的研究人员展开了深入的探索。他们把目光聚焦在碳酸酐酶 II（Carbonic Anhydrase II，CAII）上，这种酶广泛存在于各种生物体内，是一种含锌的金属酶，在人体中，它对于二氧化碳（CO2）的运输和维持细胞内的酸碱平衡起着关键作用，能催化CO2的可逆水合反应，其催化效率极高，在生理条件下，CO2水合的周转速率可达～106s?1。
研究人员经过不懈努力，取得了一系列重要成果。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们理解酶的催化机制打开了新的大门。
在研究方法上，研究人员采用了多种先进技术。其中，紫外线（UV）光解技术结合温度控制的 X 射线晶体学是关键。他们使用 3 - 硝基苯乙酸（3NPA）作为光笼分子，通过 UV 光照射使其分解产生CO2 ，从而启动 CAII 的催化反应。同时，在不同温度下收集 X 射线晶体学数据，捕捉催化过程中的中间结构。此外，还运用了定点突变技术，对 CAII 进行特定氨基酸的突变，研究活性位点水在催化过程中的作用；密度泛函理论（DFT）计算则用于分析产物结合的稳定性和构型。
研究结果
- 3NPA 和 3NT 对 CAII 的影响：结晶学研究表明，3NPA 在整个实验温度范围内都能稳定结合 CAII，且对其整体结构影响较小，不过可能会与底物竞争活性位点的结合。3NT 则不能稳定结合 CAII，对其结构和催化中间体影响也不大。通过动力学测量发现，3NPA 和 3NT 对 CAII 的CO2水合反应影响较小，分别保留了较高比例的kcat/KM和kcat 。
- 追踪 CAII 的催化途径：利用 UV 光解和温度控制的 X 射线晶体学技术，研究人员从单个 3NPA - CAII 晶体在不同温度下收集了一系列完整的 X 射线晶体学数据集。结果发现，随着温度升高，CO2逐渐取代活性位点的水分子（WDW），在 160 - 180K 时，出现了一种具有三重对称性的电子密度，结合 3NPA - apoCAII（不含Zn2+离子）的实验结果，确定该电子密度代表催化产物碳酸氢盐（HCO3? ）。这一过程成功捕捉到了底物结合、转化为产物以及产物释放的顺序事件，还有水在这个过程中的动态变化。
- 产物结合的新构型：在 3NPA - CAII - UV - 160K 结构中，发现了一种新的碳酸氢盐结合构型，与之前报道的构型不同。DFT 计算显示，这种构型在能量上是有利的，且其三个氧原子与三个活性位点水分子的位置重叠，其中一个水分子 W1 属于质子转移水网络，高度稳定且保守。
- 活性位点水的重排：为了避免 W1 与碳酸氢盐之间的空间位阻，活性位点水会发生动态运动。野生型 CAII 中，CO2结合后，W1 会发生变化，出现两个中间水分子（W和W1′），形成的碳酸氢盐会暂时占据三个活性位点水分子（WZn 、W1 和WI ）的位置，最终通过中间水分子位置进入的水分子释放。定点突变实验也证实了活性位点水在 CAII 催化中的关键作用，如 Thr200 突变为 Val200（T200V）的 CAII 变体，W1 占有率显著降低，催化效率大幅下降。
研究结论与讨论
研究人员通过实验在原子水平上捕捉到了碳酸酐酶催化过程中的中间状态，揭示了活性位点水在 CAII 高效催化中起着至关重要的作用。CAII 催化机制中的质子转移过程是速率限制步骤，发生在碳酸氢盐释放后，通过活性位点水网络向位于活性位点入口边缘的 His64 转移。由于 CAII 的周转数（kcat ）为～106s?1 ，所以从CO2转化为碳酸氢盐以及随后的碳酸氢盐释放过程必须比 1 微秒快至少一个数量级。结合之前的研究，推测活性位点水（W1、W1和W1′）的动力学发生在皮秒（ps）到纳秒（ns）的时间尺度上。
这项研究的意义重大。一方面，它加深了我们对酶催化机制的理解，表明自然酶可能已经进化出利用活性位点水的结构和快速动力学的方式，这为分子进化的研究提供了新的思路。另一方面，对于创新药物设计和生物催化剂工程具有重要的指导意义。比如在药物设计中，可以针对活性位点水的动态特性开发更有效的抑制剂；在生物催化剂工程中，通过优化活性位点水的环境来提高生物催化剂的效率。未来，进一步深入探索酶与活性位点水之间的复杂相互作用，有望在生命科学和健康医学领域取得更多的突破。
