编辑推荐：
这篇研究利用慢病毒条形码结合单细胞 RNA 测序技术，研究人乳腺癌患者来源肿瘤异种移植（PDTX）模型中的单细胞克隆。发现罕见的增殖克隆具有转录可塑性和模型特异性分化程序，为理解癌症生物学和治疗提供新视角，值得关注。
研究背景
尽管对人类癌症的分子研究已识别出多种肿瘤亚型，但疾病进展和治疗耐药仍是癌症治疗的难题。这主要归因于肿瘤细胞的克隆可塑性和亚克隆群体的动态出现。在实体癌中，由于缺乏可靠的标记物，难以对具有克隆形成活性的细胞进行表征。慢病毒条形码技术的出现，使得追踪单细胞来源的克隆成为可能，结合单细胞 RNA 测序（scRNA-seq），能深入研究恶性克隆的转录过程。
研究方法
- 构建条形码文库并验证多样性：构建三个条形码文库（BC1 - 3），将特定序列插入 pLARRY - EGFP 载体的 3′非翻译区。对 BC1 和 BC2 进行测序验证，结果显示每个文库约含 100 万个独特条形码序列，且通过计算机模拟确保其多样性满足研究需求。BC1 和 BC2 用于克隆追踪实验，BC3 用作内参。
- 慢病毒包装和转导：在 HEK293T 细胞中包装慢病毒，用包装好的慢病毒转导 PDTX 细胞，控制转导效率低于 30% 以减少多条形码整合。转导后细胞经处理植入小鼠体内。
- PDTX 解离和小鼠移植：PDTX 样本解冻后解离、去除小鼠细胞，计数后进行慢病毒转导，再植入 8 - 12 周龄雌性 NOD.Cg - PrkdcSCID Il2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）小鼠皮下。监测肿瘤生长，收获肿瘤并处理用于后续实验。
- 条形码 DNA 扩增子测序及数据分析：对细胞或质粒 DNA 进行扩增子测序，通过一系列处理步骤分析条形码序列数据，计算克隆大小等参数。
- 批量 RNA 测序及数据分析：提取 PDTX 材料的 RNA，进行文库制备和测序，对原始序列数据进行质量控制和标准化处理，通过差异基因表达分析筛选相关基因。
- scRNAseq 及数据分析：制备单细胞悬液，进行 10X Chromium scRNAseq，对数据进行处理和分析，包括细胞聚类、构建元细胞（metacell）等，以研究细胞状态和基因表达差异。
研究结果
- 克隆起始活性和罕见增殖克隆的异质性：分析 110 个来自 26 个 PDTX 模型的个体异种移植物，检测到 19,303 个克隆。克隆起始细胞（CIC）频率在不同模型间差异大，且与细胞剂量呈负相关。在二次移植实验中，发现增殖克隆极为罕见，但在二次异种移植物中常占主导地位。
- 体内克隆倍增时间揭示乳腺癌亚型特异性差异：计算体内克隆倍增时间，通过拟合混合高斯模型，将克隆分为快、中、慢三类。不同乳腺癌亚型中，各类克隆比例差异显著，且增殖克隆多为快速倍增。
- 优势增殖克隆再生完整的模型特异性转录景观：从 5 个 PDTX 模型获得 167,375 个高质量单细胞 RNA 谱，发现优势增殖克隆能产生跨越所有模型特异性细胞状态的细胞，具有强大的分化能力，且在不同二次移植复制品中表现出保守的分化程序。
- 基底型乳腺癌中的二分细胞群体：在两个基底型乳腺癌模型（STG139 和 STG201）中，发现二分细胞群体，其具有不同的克隆生长特性、信号通路激活和代谢程序。增殖克隆相关细胞具有高上皮 / 低间质特征，且与特定信号通路和代谢途径相关。
- 优势增殖克隆的动态转录可塑性：对优势增殖克隆进行转录相似性分析，发现其在不同模型中呈现不同的转录可塑性模式，如 STG139 的优势增殖克隆经历上皮 - 间质细胞状态转换，而 STG201 的则表现为上皮和间质相关基因的逐渐增加。
研究讨论
本研究构建了一个包含大量单细胞克隆和转录组数据的资源库，揭示了乳腺癌单细胞克隆的显著异质性和转录可塑性。研究发现，优势增殖克隆具有独特的适应性优势和分化程序，这与其他类型的克隆不同。尽管在某些条件下，基底型乳腺癌细胞具有较高的克隆起始频率，但具有增殖能力的克隆非常罕见。此外，研究还发现克隆的活性可在活跃和休眠状态间转换，且受非细胞自主因素影响。
研究中观察到的细胞状态转换和转录可塑性与其他上皮癌相似，提示上皮 - 间质转化在癌症细胞可塑性中起重要作用。这些发现为癌症治疗提供了新的思路，未来的治疗策略可针对与癌症增殖相关的信号和代谢通路，本研究方法也可用于研究其他实体癌，为开发新型治疗策略奠定基础。
研究局限性
本研究存在一些局限性。慢病毒转导效率限制了可追踪克隆的数量，部分模型中转导效率较高可能影响结果。PDTX 模型中乳腺癌亚型的代表性存在偏差，缺乏 luminal A 模型和仅有 1 个 HER2 模型，限制了研究结论的普适性。此外，研究未进行功能实验，未来需进一步研究克隆增殖活性所需的分子通路。
