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为解决传统电镜研究片状伪足（Lamellipodia）超微结构动态时缺乏时间分辨率的问题，研究人员结合光遗传学与冷冻电镜断层扫描（cryo-ET）开展研究，揭示了片状伪足形成过程中肌动蛋白细胞骨架和膜结构，为阐释细胞过程超微结构动态提供了新视角。
在细胞的微观世界里，片状伪足就像是细胞伸出的 “探索触角”，对细胞迁移和内吞作用起着关键作用。然而，长久以来，科学家们在研究片状伪足的超微结构动态时遇到了难题。传统的电子显微镜虽然能呈现细胞的微观结构，但由于样本固定的限制，无法捕捉到细胞结构随时间变化的动态过程，就像给运动的物体拍了一张静态照片，丢失了很多重要信息。为了深入了解片状伪足形成的机制，日本多所机构（东京理科大学、神户大学、大阪大学等）的研究人员开展了一项极具创新性的研究，相关成果发表在《iScience》杂志上。
研究人员为了攻克传统研究方法的难题，采用了光遗传学与冷冻电镜断层扫描（cryo-ET）相结合的技术。光遗传学能够通过光精确控制细胞内信号分子的激活时间，就像给细胞内的信号传递装上了一个精准的 “开关”；而 cryo-ET 可以在接近细胞生理状态下，以亚纳米分辨率重建细胞的三维结构，让科学家们能够清晰地看到细胞内部的精细结构。二者结合，为研究片状伪足形成过程中的超微结构动态提供了有力的工具。
研究结果
- 诱导片状伪足形成：研究人员选用 COS-7 细胞，利用光遗传学工具 PA-Rac1（光激活的 Rac1）在 EM 网格上诱导片状伪足形成。通过共聚焦激光扫描显微镜观察发现，蓝光照射 2 分钟内，细胞周边会出现明显的片状伪足突起，且最初的延伸通常在 2 分钟内完成，随后会有收缩和重新延伸的周期。同时，还观察到肌动蛋白逆行流动、微刺和丝状伪足的形成及运动等现象。此外，分析细胞面积变化确定了在蓝光照射 2 分钟后进行骤冷冷冻，能够捕捉到新生的片状伪足。
- 获取 cryo-ET 数据：对表达 mVenus-PA-Rac1 和 Lifeact-mCherry 的 COS-7 细胞进行蓝光照射 2 分钟后骤冷冷冻，利用 Leica Cryo-CLEM 光学显微镜筛选出具有 PA-Rac1 诱导片状伪足的细胞，再进行冷冻电镜观察并收集数据。最终从三个细胞中获得了 16 个不同延伸程度的片状伪足断层图像。通过对这些图像的分析，量化了片状伪足的结构特征，如平均厚度在 50 - 250nm，细丝密度在 2,500 - 15,000/μm3，且肌动蛋白分支在片状伪足内的频率约为外部的五倍，表明其在片状伪足形成中至关重要。
- 分析肌动蛋白细胞骨架和膜结构：
- 低延伸程度的片状伪足：在延伸约 0.5μm 的片状伪足中，前缘的质膜略有起伏，存在小突起和凹面区域。小突起中肌动蛋白丝向边缘延伸但未束状聚集，凹面区域的肌动蛋白丝单独向边缘延伸，此时片状伪足内部未检测到束状肌动蛋白丝。
- 中等延伸程度的片状伪足：延伸至约 1.5μm 的片状伪足中，前缘出现大突起，其中一些肌动蛋白丝聚集形成类似微刺和丝状伪足的结构，被称为 “迷你丝状伪足”，其间距约 8nm，推测存在 fascin 介导的交联。同时，大突起的质膜上有局部高密度区域，可能与特定脂质或蛋白质聚集有关。在片状伪足内部，有长肌动蛋白丝平行于前缘排列，形成了有序的肌动蛋白网络。
- 高延伸程度的片状伪足：在延伸超过 3μm 的片状伪足中，观察到明显的微刺和丝状伪足，其内部有许多平行于前缘的束状肌动蛋白丝，这些丝可能由迷你丝状伪足成熟或脱离前缘形成。此外，还发现不同区域的肌动蛋白丝取向存在差异，后缘区域在 30° - 40° 和 90° 左右有峰值。
- 比较前后区域差异：对片状伪足前后区域的分析发现，尽管肌动蛋白丝取向有所不同，但除前缘质膜相关结构外，前后区域的肌动蛋白细胞骨架结构差异并不显著。同时，发现 Lifeact-mCherry 荧光强度与肌动蛋白密度之间存在差异，可能是由于肌动蛋白聚合和解聚活跃区域的 G - 肌动蛋白影响，以及肌动蛋白逆行流动导致荧光蛋白分布改变。
- 分析收敛区和皮质区域：片状伪足收敛区的肌动蛋白细胞骨架主要呈无序状态，分支少且细丝弯曲度高；皮质肌动蛋白束由长丝状肌动蛋白组成，且有微管与肌动蛋白束平行排列，此外还观察到管状膜结构，表明内质网（ER）的存在，体现了微管和内质网在细胞运输和维持结构完整性中的作用。
研究结论与讨论
这项研究通过光遗传学与 cryo-ET 相结合的方法，为研究细胞内动态过程的超微结构提供了新的框架。研究揭示了片状伪足形成过程中肌动蛋白细胞骨架和膜结构的组织和功能，提出了一个关于片状伪足形成的假设模型：肌动蛋白在质膜特定区域聚合形成小突起，小突起发展为迷你丝状伪足推动质膜向前，部分进一步成熟为丝状伪足，部分脱离前缘平行于前缘排列，这些结构的周转促进了片状伪足的延伸。该模型补充了传统 Arp2/3 介导的分支在片状伪足延伸中的作用，为深入理解片状伪足动力学提供了新的视角。
然而，该研究也存在一些局限性。样本量较小，仅对三个细胞的 16 个断层图像进行分析，可能存在选择偏倚。同时，实验方法也存在一定缺陷，如印迹过程可能对肌动蛋白细胞骨架产生影响，cryo-CLEM 的准确性受限于缺乏精确相关的荧光标记，且分析时排除了部分较短和特定取向的肌动蛋白丝，限制了对肌动蛋白网络复杂性的全面分析。
尽管如此，这项研究仍然意义重大。它不仅让我们对片状伪足形成的机制有了更深入的理解，也为后续研究提供了重要的参考。未来的研究可以在扩大样本量、改进实验方法的基础上，进一步验证和完善这一模型，探索更多细胞过程中超微结构动态的奥秘，为生命科学和健康医学领域的发展做出更大的贡献。
