纳米孔直接 RNA 测序揭示 mRNA 修饰复杂性及调控特征间相互作用 —— 白血病研究新突破

本文利用牛津纳米孔长读长直接 RNA 测序（dRNA-seq），研究人类白血病细胞系转录组和表观转录组。通过分析 N6- 甲基腺苷（m6A）修饰、mRNA 丰度等特征的相关性，揭示 RNA 修饰复杂性及调控元件间相互作用，为相关研究提供重要数据资源。

　　

研究背景

RNA 是一种功能多样的分子，其化学修饰在生命过程中发挥着关键作用。N⁶- 甲基腺苷（m⁶A）修饰是 mRNA 上最丰富的内部修饰之一，参与调控干细胞功能、免疫反应和癌症发展等多种生理过程 。此前研究虽揭示了 m⁶A 修饰与 mRNA 其他特征之间存在关联，但多是基于独立技术和不同实验样本推断得出，缺乏全基因组范围的直接证据。牛津纳米孔长读长直接 RNA 测序（dRNA-seq）技术可对天然 mRNA 分子进行测序，保留化学修饰信息，为研究 RNA 修饰与其他特征的关系提供了新途径。

研究方法

1. 细胞培养与处理：使用人髓系白血病细胞系 MOLM13 和人胚肾细胞系 HEK293T。MOLM13 细胞在含 10% 胎牛血清、青霉素和链霉素的 RPMI-1640 培养基中培养；HEK293T 细胞在含相同添加剂的 DMEM 培养基中培养，均置于 37°C、5% CO₂的培养箱中。通过慢病毒介导的短发夹 RNA（shRNA）技术，构建 METTL3 基因敲低（KD）的 MOLM13 细胞模型，用于后续研究 m⁶A 修饰变化的影响。
2. RNA 测序相关实验：提取细胞总 RNA 后，进行 poly (A) 富集，利用 Direct RNA Sequencing Kit（SQK_RNA002）构建直接 RNA 文库，并在 PromethION 48 仪器上进行测序，测序数据通过 Guppy 进行碱基识别。同时，对 MOLM13 细胞用 1 μM 曲古抑菌素（triptolide）处理，阻断转录，在不同时间点收集细胞，提取 RNA 进行 mRNA 半衰期测序，用于分析 mRNA 稳定性。
3. 数据分析方法：使用 Minimap2 将测序 reads 比对到转录组，利用 f5c “eventalign” 进行信号分割和分析。采用 m6Anet 软件识别 m⁶A 位点并计算修饰比例，通过 TailfindR 和 Nanopolish 估计 poly (A) 尾长度，运用 Isoquant 和 FLAIR 分析可变剪接事件，使用 Bambu 量化基因表达水平，通过多种统计方法和工具进行相关性分析和富集分析。

研究结果

1. dRNA-seq 数据质量评估及 m⁶A 修饰分析：对 4 个对照样本和 2 个 METTL3-KD 样本进行 dRNA-seq，共获得超 3400 万条 reads，数据质量高，覆盖度好。通过 m6Anet 分析发现，对照样本间 m⁶A 修饰具有高重复性。与已有的 miCLIP-seq 等技术相比，dRNA-seq 检测到的 m⁶A 位点有一定重叠，且在单个位点分析层面，dRNA-seq 能可靠检测 m⁶A 修饰。在 METTL3-KD 样本中，m⁶A 甲基化位点数量和修饰频率显著降低，相关基因主要涉及核糖核蛋白复合体生物发生、RNA 剪接和 mRNA 加工等过程。
2. m⁶A 修饰与 mRNA 特征的相关性：评估 m⁶A 修饰与 mRNA 丰度、稳定性和翻译活性的关系发现，在稳态下，mRNA 丰度与 m⁶A 修饰的相关性较弱，且受修饰化学计量和修饰位点数量影响。甲基化的 mRNA 半衰期明显短于未甲基化的转录本，m⁶A 修饰频率和密度越高，mRNA 稳定性越低。同时，m⁶A 修饰与翻译活性呈负相关，增加 m⁶A 修饰会减少核糖体结合。在 METTL3-KD 样本中，多数下调和上调的 mRNA 转录本与 m⁶A 甲基化减少相关，且相关基因分别参与不同的生物学过程。
3. poly (A) 尾长度的全基因组特征及相关性分析：利用 dRNA-seq 可在单分子分辨率下全基因组评估 mRNA 的 poly (A) 尾长度，其估计结果在独立对照样本间重复性高，且与 Nanopolish 的结果相关性强。将转录本按 poly (A) 尾长度分为短、中、长三组后发现，较长的 RNA 特征（如编码序列、非翻译区）与较长的 poly (A) 尾相关，且序列中 AU 含量与 poly (A) 尾长度呈正相关。此外，研究还发现 poly (A) 尾长度与 mRNA 丰度和稳定性呈负相关，这挑战了传统认为长 poly (A) 尾的转录本更稳定且表达水平更高的观点。
4. m⁶A 修饰与 poly (A) 尾长度的关系：研究发现，总体上修饰的转录本比未修饰的转录本具有更长的 poly (A) 尾，但只有少数基因在修饰和未修饰转录本间有显著差异。进一步分析发现，m⁶A 修饰比例、修饰位点数量与 poly (A) 尾长度的相关性因修饰位点位置而异。在 METTL3-KD 样本中，部分转录本的 poly (A) 尾长度发生显著变化，相关基因分别富集在不同的生物学过程中，表明 m⁶A 和 poly (A) 尾的调控可能由 METTL3 协调，且涉及一小部分 m⁶A 靶标。
5. METTL3 介导的 m⁶A 调控与可变剪接：利用 Isoquant 和 FLAIR 分析发现，METTL3-KD 样本与对照样本相比，有多种可变剪接事件发生变化，其中外显子跳跃（ES）和内含子保留（IR）变化最为显著。分析 m⁶A 修饰与可变剪接事件的关联发现，不同 m⁶A 修饰比例和修饰位点数量的转录本，其可变剪接事件数量不同，且 m⁶A 位点与可变剪接位点的空间 proximity 存在差异，表明 m⁶A 修饰可能对可变剪接有差异调控作用。

研究讨论

本研究利用 dRNA-seq 深入探究了人类白血病细胞的转录组和表观转录组，验证了 poly (A) 尾长度与转录本丰度的负相关关系，修正了对长 poly (A) 尾与基因稳定性和表达关系的传统认知。同时，详细刻画了 m⁶A 修饰与 poly (A) 尾长度的复杂相关性，揭示了 m⁶A 对 mRNA 转录本的精细调控模式。但研究也存在局限性，如分析多为相关性研究，缺乏功能验证；实验采用 poly (A) 富集，需进一步比较总 RNA 和 poly (A) 富集材料；dRNA-seq 技术的准确性和通量有待提高等。未来随着技术的发展和优化，dRNA-seq 将在 RNA 生物学研究中发挥更大作用。