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本文研究发现蛋白酶 K（ProK）消化会大幅降低蛋白质抗原性，而高压锅处理可解决 TUNEL 与空间蛋白质组学方法的不兼容性。优化后的 TUNEL + 空间蛋白质组学方案，能丰富细胞死亡的空间信息，为研究细胞死亡机制提供了有力工具。
研究背景
末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 缺口末端标记（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling，TUNEL）是一种经典的原位定位细胞死亡的方法，在细胞死亡研究中具有重要意义。它能够在固定组织中详细阐述细胞死亡的空间背景，对于理解细胞死亡的过程和机制至关重要。然而，TUNEL 存在一些局限性。它难以通过免疫荧光（immunofluorescence，IF）共定位超过 2 - 3 个额外的蛋白质靶点，这限制了对细胞死亡与组织环境之间空间和机制关系的全面分析。同时，TUNEL 需要专用的一次性载玻片标本，对于珍稀的临床标本来说，这种使用方式十分受限。
近年来，多种新的或改进的多重蛋白质标记技术不断涌现，如迭代间接 IF 成像（4i）、循环免疫荧光（Cyclic Immunofluorescence，CycIF）、抗体新沉积多重迭代标记（multiple iterative labeling by antibody neodeposition，MILAN）等。这些技术可以在一个组织标本中对 20 - 80 个蛋白质靶点进行顺序或同时染色，极大地推动了蛋白质研究的发展。MILAN 方法在临床病理实验室常规处理的福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）切片上即可进行，不需要特殊的抗体结合或漂白设备，且具有高效的抗体擦除和抗原修复能力，还能兼容 - 20°C 长期保存玻片，有利于珍贵组织资源的保存和后续使用。但 TUNEL 与这些现代多重空间蛋白质组学方法的兼容性尚未得到研究，本研究旨在探索两者能否协调使用，为细胞死亡研究提供更全面的视角。
实验设计
研究人员建立了小鼠肝坏死和肾上腺皮质凋亡的模型，以此作为研究细胞死亡的生物参考。在肝坏死模型中，利用对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）诱导小鼠肝脏产生毒性，引发肝细胞死亡，这种坏死在空间上呈现出特定的模式，围绕中央静脉的 1 - 2 层细胞在 APAP 暴露 6 小时后坏死最为明显，可通过商业的基于辣根过氧化物酶的 TUNEL 检测法清晰观察到。在肾上腺皮质凋亡模型中，通过给予小鼠地塞米松（dexamethasone，DEX）处理，诱导肾上腺皮质细胞死亡，同时设置给予促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）类似物 cosyntropin（COS）的实验组，以观察其对凋亡的影响。
实验过程中，研究人员对 TUNEL 实验方案进行了优化，重点研究了不同抗原修复方法对 TUNEL 信号和蛋白质抗原性的影响。比较了蛋白酶 K（ProK）处理、MILAN 的 2 - 巯基乙醇 / 十二烷基硫酸钠（2 - mercaptoethanol/sodium dodecyl sulfate，2 - ME/SDS）“剥离” 缓冲液处理、高压锅（pressure cooker，PC）在 Tris - EDTA 缓冲液（pH = 9）中处理以及不进行抗原修复这几种方式。同时，评估了不同 TUNEL 变体（包括两种商业试剂盒和一种自制检测法）与抗原修复方法结合后的效果，还探究了 TUNEL 在 MILAN 染色系列中的最佳执行顺序，以及 TUNEL 与 CycIF 方法的兼容性。
实验结果
- 抗体 TUNEL 可在 2 - ME/SDS 中擦除：研究人员优化的自制（in-house，IH）基于抗体的 TUNEL 检测法，在检测 APAP 诱导的小鼠肝坏死时，与商业试剂盒的结果匹配良好。对 PC - IH 6h - APAP TUNEL 处理的标本进行实验发现，其在 2 - ME/SDS 中孵育后，可完全擦除 TUNEL 信号，且重新染色后能保留抗原性，表明基于抗体的 TUNEL 检测法与 MILAN 的擦除步骤兼容，为后续实验奠定了基础。
- 不同抗原修复方法对 TUNEL 信号的影响：在比较不同抗原修复方法对 TUNEL 信号保真度的影响时，发现 ProK - IH 在 6h - APAP 小鼠肝脏切片中产生的绝对信号最亮，但所有测试的抗原修复方法（包括 ProK 处理、STR 处理、PC 处理和不处理）都能产生特征性的 TUNEL 染色，且 TUNEL 阳性区域的厚度在不同抗原修复策略之间没有差异，说明这些方法在检测 TUNEL 信号方面具有相似的空间分布能力。在检测 DEX 处理的小鼠肾上腺凋亡时，PC - IH 和商业 Click - iT 检测法都能有效检测到凋亡变化，PC - IH 产生的 TUNEL 阳性细胞数量更多，且样本间变异性更小，显示出其作为一种可靠的抗原修复策略的潜力。
- ProK 对蛋白质抗原性的影响：研究发现 ProK 处理会显著改变或消除 FFPE 标本中多种蛋白质的抗原性。在对肝脏切片进行染色时，Click - iT 方案（包含 ProK 抗原修复）完全消除了 β - catenin 信号，使白蛋白染色明显减弱并出现异常的核定位模式。而 PC - IH 方案则能保留正常的蛋白质染色模式。通过抗原修复交叉实验进一步证实，ProK 会导致蛋白质信号大量丢失，且这种损失在一定程度上是不可逆的，PC 处理则能增强蛋白质信号。在肾上腺和乳腺组织中也观察到类似的现象，ProK 处理会降低相关蛋白质的抗原性，而 PC - IH 则能更好地保留抗原性。
- TUNEL 在 MILAN 染色系列中的整合：探究 TUNEL 在 MILAN 染色系列中的执行顺序发现，TUNEL 可以在 MILAN 免疫染色轮次之后进行，且不会影响后续的免疫染色。在 6h - APAP 肝切片实验中，先进行 MILAN 免疫染色再进行 TUNEL 染色，TUNEL 信号依然稳健，且重复染色的白蛋白信号有所增强。此外，TUNEL 在 MILAN 染色系列的早期进行（如第一轮或第四轮之前），既能保证 TUNEL 和免疫染色的完整性，又能避免对蛋白质抗原性的影响，有助于更清晰地观察 APAP 诱导的肝毒性过程中肝小叶的结构和细胞死亡情况。
- DEX 处理对肾上腺的影响：利用 PC - IH TUNEL - MILAN 检测法对 DEX 处理的小鼠肾上腺进行研究，发现 DEX 会导致肾上腺皮质凋亡和增殖增加。TUNEL 和 cleaved caspase - 3 信号主要集中在肾上腺皮质的 zona fasciculata（zF）区域，且 DEX 处理后两者信号均显著增加。同时，通过对增殖标记物 Pcna 和 Ki - 67 的检测，发现 DEX 处理会使肾上腺皮质的增殖增加，而 COS 的共同处理则部分抑制了这种增殖，这一结果揭示了肾上腺皮质在 DEX 处理下的复杂变化，也表明该检测法能够有效地在同一标本中对细胞死亡和增殖进行空间定位和研究。
- TUNEL 与 CycIF 的兼容性：研究表明基于 PC 的 TUNEL 程序与 CycIF 兼容。在 DEX 处理的小鼠肾上腺模型中，使用 CycIF 方法进行检测，TUNEL 信号在 DEX 处理的肾上腺中表现出预期的分布，且与其他蛋白质标记物的染色和擦除过程相互兼容，能够有效地检测到细胞死亡和增殖相关的信号变化，进一步验证了优化后的 TUNEL 方案在多种多重迭代 IF 方法中的适用性。
研究结论
本研究成功优化了一种可擦除的 TUNEL 方案，并将其与 MILAN 和 CycIF 协调整合。研究发现 ProK 并非 TUNEL 信号检测的必需条件，PC 处理不仅足以产生可靠的 TUNEL 信号，还能减少信号变异性，同时减轻传统 TUNEL 与 IF 协议之间的主要不兼容性。这种协调后的方案能够在复杂组织中对细胞死亡进行丰富的空间背景分析，为研究细胞死亡机制提供了强大的工具。
在 APAP 诱导的肝毒性研究中，通过多重共染色揭示了谷胱甘肽定位与坏死细胞死亡之间的强反相关性，进一步加深了对肝毒性机制的理解。在 DEX 诱导的肾上腺皮质凋亡研究中，虽然支持了 ACTH 的抗凋亡作用，但也提出了关于肾上腺皮质在缺乏 ACTH 分泌时增殖机制的新问题。此外，研究还发现了 TUNEL 与 cleaved caspase - 3 的有限共定位以及 TUNEL 信号在 DAPI 染色减少区域出现的现象，这些发现挑战了传统对 TUNEL 作为凋亡标记物的认知，强调了高度多重共定位在解析细胞死亡机制中的潜力。
然而，本研究也存在一定的局限性。虽然在三种不同组织和两种多重迭代 IF 方法中验证了主要的协调方案，但关于信号噪声以及 TUNEL 对 IF 的影响等详细结论，在肝脏和肾上腺组织中使用 MILAN 时最为可靠，对于其他组织和 CycIF 信号的影响还需要进一步研究确认。同时，PC - IH TUNEL 方案在非腺性组织和肿瘤组织中的适用性也有待探索。未来，需要更多的研究来进一步完善和拓展这一研究成果，为生命科学和健康医学领域对细胞死亡的研究提供更深入的见解。
