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这篇研究通过分析癌症基因组数据，发现黑色素瘤中部分突变被错误注释。研究人员重新注释突变，鉴定出如 IRF3/BCL2L12 启动子突变等功能性非编码突变，还提出新注释方法，为癌症研究及精准医疗提供重要依据。
研究背景
下一代测序技术虽革新了癌症样本突变检测，但目前多数临床和科研人员解读测序结果时，常忽略同义突变。实际上，同义突变可通过多种机制影响基因表达，如改变剪接、miRNA 结合、mRNA 二级结构及 tRNA 可用性等，进而影响肿瘤发展和药物敏感性。此前研究在同义突变分析方面存在局限，如优先关注已知癌症基因、单独分析同义突变、仅依赖 DNA 测序（DNA-seq）数据等，难以全面了解候选致病同义突变情况。因此，本研究旨在克服这些局限，探究癌症基因组数据中候选致病同义及错义突变情况。
材料和方法
- 数据来源：研究使用了 TCGA 癌症基因组数据中高置信度的体细胞突变数据、mRNA 表达数据、RNA 测序（RNA-seq）BAM 文件，还利用了 COSMIC 数据库中的皮肤肿瘤 DNA-seq 数据以及其他相关研究的免疫治疗数据等。同时，下载了 ENCODE 的 DNase 测序（DNase-seq）和染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据。
- 突变浓度分析：对 MC3 工作组的体细胞 TCGA 变异调用数据进行预处理，保留特定类型的单核苷酸变异（SNVs），去除免疫相关基因、非表达基因、超突变肿瘤及低变异等位基因分数（VAF）的变异。运用四种互补方法（热点 3 法、热点 12 法、突变浓度法、熵法）识别基因中显著的突变聚集区域，并通过置换检验评估显著性。
- 细胞实验相关方法：培养 Mel-ST 细胞和 HEK-293T 细胞，利用 CRISPR-Cas9 技术构建突变细胞系，通过 RT-qPCR 检测 mRNA 表达水平，使用蛋白质电泳和 western blot 检测蛋白表达，进行 shRNA 转导实验，还运用多种工具进行转录因子结合分析及荧光素酶报告基因检测。
- 突变注释及相关分析方法：利用 Salmon 和 Ensembl VEP 工具，根据特定肿瘤类型的转录组 BAM 文件确定主要表达转录本并注释突变。通过纳米孔测序分析转录本异构体，分析突变对 RNA 表达的影响。
研究结果
- 黑色素瘤中显著突变簇的情况：对 TCGA 数据中 17 种肿瘤类型进行分析，发现黑色素瘤（SKCM）中具有显著浓度突变的基因数量最多。研究重新鉴定出已知的致癌基因，如 BRAF 和 NRAS，还发现了一些基因中以前未被关注的同义突变聚集区域，如 CAMK4、SLC27A5 和 KNSTRN。
- BCL2L12 突变的重新注释：研究发现先前描述的 BCL2L12 p.Phe17 = 突变是一个未被识别的突变簇的一部分。通过分析多种数据，确定在黑色素瘤中，该突变簇中的突变实际为 IRF3/BCL2L12 启动子的非编码突变，这些突变影响约 3.8%-5.5% 的黑色素瘤肿瘤。
- IRF3/BCL2L12 启动子突变的功能影响：在黑色素瘤肿瘤样本和 Mel-ST 细胞模型中，IRF3/BCL2L12 启动子突变显著降低 IRF3 和 BCL2L12 的 mRNA 和蛋白表达水平。这些突变还影响转录因子结合，降低启动子活性，进而下调 TP53 及其靶基因 CDKN1A 的表达。携带这些突变的黑色素瘤患者对免疫治疗的反应更差。
- 其他基因的突变情况：对 KNSTRN、SLC27A5 和 CAMK4 基因的研究发现，KNSTRN 和 SLC27A5 的突变对应于非编码启动子突变，而 CAMK4 的特定突变是真正的同义突变。KNSTRN 启动子突变可影响转录因子结合和启动子活性，SLC27A5 启动子突变与基因表达增加相关。
- 突变注释准确性评估：利用 Salmon 和 VEP 对黑色素瘤中 52 个基因的突变进行注释，发现该方法在确定主要表达转录本和注释突变方面具有较高准确性。经手动验证，22%（11/50）的分析突变实际上是非编码突变，其中多个突变靶向基因启动子区域，部分还影响相邻基因。
讨论
本研究开发的方法克服了以往研究的局限，能同时筛选候选致病同义及错义突变，鉴定出许多已知和未知的癌症相关突变热点。但严格的筛选可能导致遗漏低频变异或样本量有限的肿瘤类型中的变异。现有多数突变检测流程和数据库基于参考转录本注释突变，易造成错误注释，如 BCL2L12、KNSTRN 和 SLC27A5 基因的突变。本研究利用 CRISPR-Cas9 构建的等基因敲入模型，为研究非编码突变功能提供了更准确的手段。研究还发现黑色素瘤中一些非编码突变对肿瘤抑制基因 TP53 等的表达产生重要影响，且可能影响免疫治疗反应。此外，提出的自动化注释方法可提高突变注释准确性，但仍需进一步研究某些基因中多种转录本导致的突变功能复杂性问题。在其他肿瘤类型（如乳腺癌和低级别胶质瘤 / 多形性胶质母细胞瘤）中，未发现明显的非编码突变，可能与这些肿瘤类型中显著突变簇数量有限或黑色素瘤中特定非编码突变发生率较高有关。总之，本研究为癌症基因组学领域做出重要贡献，识别出黑色素瘤中的功能性非编码突变，并提出整合 DNA-seq 和 RNA-seq 数据进行突变注释的方法，对癌症研究和临床实践具有重要意义。
数据可用性
Mel-ST 细胞的 ONT 测序结果已在 NCBI SRA 和 GEO 数据库公开，研究中开发的突变浓度分析代码及使用的 SKCM 数据集可在 Github 获取。
