跨菌种荧光标记穿梭载体的构建与应用：pKEK-Chrom质粒系列在非模式革兰氏阴性菌中的多功能表达系统

本研究开发了32种pKEK-Chrom穿梭质粒，整合8种发色团蛋白（CCPs）、可替换启动子（BsaI介导的Golden Gate组装）及双复制子（p15a-FnOri/RSF1010），解决了非模式菌（如Francisella novicida、Acinetobacter baumannii）中基因工具匮乏的难题。通过启动子交换和广宿主复制策略，实现在Escherichia coli、Vibrio alginolyticus等5类革兰氏阴性菌中的高效荧光标记，为微生物研究提供模块化工具包。

　　

跨菌种荧光标记穿梭载体的创新设计与验证

ABSTRACT
发色团蛋白（CCPs）包括荧光蛋白和非荧光显色蛋白，已成为微生物研究的关键工具。然而，在缺乏成熟遗传系统的非模式细菌中应用CCPs面临转化效率、复制子兼容性和启动子选择等挑战。研究团队构建了32种pKEK-Chrom穿梭质粒，包含8种CCPs（如eforCP、DasherGFP、tsPurple）、双抗生素标记（Kan^R/Cm^R）和两种复制子（p15a-FnOri或RSF1010-p15a），并通过BsaI位点实现启动子（pJ23100）的Golden Gate交换。该系统在Escherichia coli、Shewanella oneidensis等5种革兰氏阴性菌中验证了功能，显著拓展了CCPs的应用范围。

INTRODUCTION
自维多利亚水母GFP发现以来，CCPs家族已衍生出多种光谱特性的成员。但非模式菌的遗传异质性（如Francisella的RNA聚合酶特异性）限制了传统载体的适用性。研究以Francisella novicida和Acinetobacter baumannii为模型，针对复制子稳定性（FnOri/RSF1010）和启动子兼容性（pJ23100-BsaI）进行工程化改造，建立标准化表达工具。

MATERIALS AND METHODS
载体构建采用Golden Gate组装技术，CCP基因片段通过BsaI-HFv2酶切连接至含p15a-FnOri-oriT或RSF1010-p15a的骨架。启动子交换通过含CGAC/ATTA粘末端的pGroEL-PCR片段实现。功能验证涵盖E. coli（37°C）、Vibrio alginolyticus（30°C高盐培养基）等菌株的荧光显微成像和接合转移实验。

RESULTS

1. 多宿主兼容性验证
   在E. coli中，所有CCPs均显色，其中sfGFP/DasherGFP在绿光通道（470 nm激发）表现最佳，而sfCherry2在红光通道（390 nm激发）特异性最强。V. alginolyticus中仅sfCherry2和DasherGFP稳定表达，凸显宿主代谢对CCP活性的影响。

2. 启动子交换技术
   通过BsaI酶切将Francisella特异性pGroEL启动子替换pJ23100后，F. novicida中sfGFP表达量提升20倍（荧光显微镜定量）。值得注意的是，温度敏感型aeBlue在30°C下显色微弱，印证其热不稳定性。

3. 广宿主复制子优化
   RSF1010载体在A. baumannii中成功表达6种CCPs（除FuGFP），其天然oriT元件使接合效率达10^-3/供体细胞。相比之下，p15a-FnOri在该菌中完全失效，证实RSF1010对γ-变形菌纲的广谱适应性。

DISCUSSION
pKEK-Chrom系列通过模块化设计解决了三大瓶颈：

• 遗传工具匮乏：双复制子策略覆盖90%测试菌株
• 表达调控障碍：BsaI位点支持72小时内完成启动子高通量筛选
• 技术兼容性：IP-free的DasherGFP/tsPurple降低商业授权限制

在Francisella中，pGroEL驱动sfGFP的荧光强度达E. coli水平的60%，为胞内病原体研究提供新工具。未来可扩展至CRISPRi等动态调控系统，进一步推动非模式菌的合成生物学应用。

技术亮点

• 首创将tsPurple用于蓝白筛选替代方案
• RSF1010在A. baumannii的稳定维持率>95%（50代）
• 接合转移效率突破10^-2（S. oneidensis）

该研究为微生物群落分析、病原体追踪等场景提供了标准化解决方案，相关质粒已存放Addgene（ID 234085-234108）。