吲哚 - 3 - 乙醇：肠杆菌与宋内志贺菌间细胞通讯的关键 “信使” 及潜在治疗靶点

本文聚焦群体感应（QS）机制，研究发现阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）利用吲哚 - 3 - 乙醇调控自身功能和致病性，还能抑制宋内志贺菌（Shigella sonnei）的生物膜形成、胞外多糖合成及毒力，为肠道微生物研究和抗菌治疗提供新方向。

　　

引言

群体感应（Quorum sensing，QS）是细菌和真菌中广泛存在的细胞间通讯机制，它依赖细胞密度，能协调细菌的一系列重要生理活动，像生物膜形成、运动性、毒力因子产生以及抗生素抗性等 。在革兰氏阴性菌中，研究较多的 QS 系统是 N - 酰基 - L - 高丝氨酸内酯（N-acyl-L-homoserine lactone，AHL），此外还有扩散性信号因子（diffusible signaling factor，DSF）家族信号、自诱导物 - 2（autoinducer-2，AI-2）等多种 QS 信号被发现。在真菌中，QS 系统也起着关键作用，比如法尼醇、酪醇以及吲哚 - 3 - 乙醇（indole-3-ethanol，也叫色醇）等作为 QS 分子，参与调控真菌的形态发生、生物膜形成等过程 。不过，吲哚 - 3 - 乙醇对细菌生物学功能的调控研究还比较少。

阴沟肠杆菌是一种机会性革兰氏阴性病原体，可引发呼吸道和泌尿道感染，尤其在免疫功能低下的人群中 。此前研究虽对其 QS 相关现象有所探索，但尚未发现其产生的 QS 信号分子。宋内志贺菌是引起细菌性痢疾的主要病原体之一，其致病性与生物膜形成密切相关，而生物膜形成又受 QS 信号分子 4 - 羟基苯甲酸（4-hydroxybenzoic acid，4-HBA）的调控 。鉴于这两种菌在临床和肠道感染中的重要性，本研究旨在探索阴沟肠杆菌与宋内志贺菌之间是否通过 QS 信号相互作用，进而影响宋内志贺菌的致病行为。

结果

1. 阴沟肠杆菌提取物抑制宋内志贺菌的致病表型：某些肠道微生物能抑制病原体定植，基于此，研究人员对阴沟肠杆菌进行研究。通过乙酸乙酯萃取阴沟肠杆菌液体培养物，得到低分子量化合物，经蒸发浓缩和甲醇溶解后进行定量分析。结果发现，添加阴沟肠杆菌乙酸乙酯提取物可降低宋内志贺菌中胞外多糖（extracellular polysaccharide，EPS）生物合成及生物膜相关基因（如 wza、g4c、csgB）的转录水平，但对其生长影响不明显，这表明阴沟肠杆菌产生的化合物可能通过干扰生物膜形成，影响宋内志贺菌的定植和感染能力。
2. 阴沟肠杆菌的主要活性成分是吲哚 - 3 - 乙醇：为确定阴沟肠杆菌中抑制宋内志贺菌生物膜形成和 EPS 生物合成的活性成分，研究人员从 100L 阴沟肠杆菌培养上清中，利用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）进行分离纯化，并通过核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）光谱和电喷雾电离串联质谱（electrospray ionization tandem mass spectrometry，ESI-MS）分析鉴定化合物结构。最终确定主要活性化合物为吲哚 - 3 - 乙醇，同时还鉴定出吲哚 - 3 - 丙酮酸、吲哚 - 3 - 甲醇和吲哚等其他活性化合物。进一步实验发现，吲哚 - 3 - 乙醇降低宋内志贺菌中 wza、g4c 和 csgB 转录水平的能力最强。
3. 吲哚 - 3 - 乙醇以剂量依赖方式抑制宋内志贺菌的致病表型：研究人员用不同浓度的吲哚 - 3 - 乙醇处理宋内志贺菌，利用与关键生物膜和毒力基因相连的报告系统检测发现，吲哚 - 3 - 乙醇对宋内志贺菌生物膜形成、EPS 产生以及细胞毒性的抑制作用呈剂量依赖性。此外，吲哚 - 3 - 乙醇还能促进宋内志贺菌生物膜的分散，且对其生长速率影响较小。实验还验证了市售合成的吲哚 - 3 - 乙醇与阴沟肠杆菌产生的吲哚 - 3 - 乙醇效果相同。
4. 吲哚 - 3 - 乙醇抑制宋内志贺菌的 QS 信号系统：为探究吲哚 - 3 - 乙醇抑制宋内志贺菌毒力表型的机制，研究人员检测其是否干扰与生物膜形成和 EPS 合成相关的信号系统。通过 RNA 测序（RNA sequencing，RNA-Seq）和逆转录定量聚合酶链反应（reverse transcription quantitative PCR，RT-qPCR）发现，吲哚 - 3 - 乙醇处理后，宋内志贺菌中参与 QS 分子合成的 trpE 和 ubiC 基因显著下调，相应的 QS 分子邻氨基苯甲酸和 4 - HBA 水平也明显降低。同时，吲哚 - 3 - 乙醇还抑制了 VI 型分泌系统相关基因 tssG 以及多个 EPS 生物合成相关基因的表达。
5. YjgB 负责阴沟肠杆菌中吲哚 - 3 - 乙醇的生物合成：在大肠杆菌中，由 yjgB 编码的醇脱氢酶是吲哚 - 3 - 乙醇生物合成的关键酶。研究人员通过在阴沟肠杆菌基因组中搜索 yjgB 同源物，鉴定出 ECL_RS22935 基因。敲除 yjgB 几乎完全消除了吲哚 - 3 - 乙醇的产生，但不影响细菌在 LB 培养基中的生长速率。纯化的 YjgB 融合蛋白体外酶活性测定表明，YjgB 可直接催化吲哚 - 3 - 乙醛转化为吲哚 - 3 - 乙醇。
6. 敲除 yjgB 损害阴沟肠杆菌的生物学功能：由于吲哚 - 3 - 乙醇能通过种间干扰抑制宋内志贺菌的生物膜形成和 EPS 合成，研究人员进一步探究其对阴沟肠杆菌生物学功能的调节作用。结果显示，敲除 yjgB 显著损害了阴沟肠杆菌的生物膜形成、运动性和 EPS 产生等表型，尤其对运动性影响较大，但对细菌细胞生长影响较小。而过表达 yjgB 或外源添加 20μM 吲哚 - 3 - 乙醇可使 yjgB 敲除突变体的表型恢复到野生型水平。此外，与野生型阴沟肠杆菌相比，yjgB 敲除突变体对 A549 细胞的细胞毒性在接种 8 小时后降低了 49%，这表明吲哚 - 3 - 乙醇在阴沟肠杆菌的种内信号传导中，对调节生物学功能和致病性起着关键作用。
7. 吲哚 - 3 - 乙醇的产生具有细胞密度依赖性和自诱导性：研究人员分析了吲哚 - 3 - 乙醇在不同生长阶段的产生情况，发现其产量在初始生长阶段较低，随着细胞密度增加，4 小时后显著增加，12 小时达到峰值 50.5μM，之后开始下降。同时检测 yjgB 的转录情况，发现其转录水平变化与吲哚 - 3 - 乙醇的积累趋势密切相关。进一步实验表明，外源添加 20μM 吲哚 - 3 - 乙醇可使 yjgB 敲除突变体中 yjgB 的启动子活性恢复到接近野生型水平，说明吲哚 - 3 - 乙醇的产生可能在转录水平上存在自调节机制。
8. 吲哚 - 3 - 乙醇控制广泛基因的表达水平：通过 RNA-Seq 分析阴沟肠杆菌野生型和 yjgB 敲除突变体的转录组，发现与野生型相比，yjgB 突变体中有 26 个基因上调，156 个基因下调。这些差异表达基因涉及多种生物学功能，包括运动性、细胞附着、应激耐受性、毒力、调节、膜成分、运输、代谢、多药耐药性和信号转导等。其中，一些鞭毛相关基因、细菌分泌系统相关基因以及碳水化合物代谢相关基因的转录水平下调，这可能影响阴沟肠杆菌的运动性、毒力和 EPS 合成等过程。

讨论

QS 是细菌和真菌中复杂而精妙的细胞间通讯机制，多种 QS 信号已被发现，吲哚及其衍生物在细菌中被认为是关键的 QS 信号分子，参与调节微生物行为和种间、种内相互作用 。本研究不仅阐明了吲哚 - 3 - 乙醇在阴沟肠杆菌中的重要生物学功能，还揭示了其对宋内志贺菌生物膜形成、EPS 产生和生物膜分散的抑制作用。转录组分析表明，敲除吲哚 - 3 - 乙醇合成酶编码基因 yjgB 会显著改变阴沟肠杆菌约 200 个基因的表达，这进一步支持了吲哚及其衍生物作为 “吲哚家族 QS 信号” 在细菌中广泛存在，并调节多种关键生理过程的观点，加深了对吲哚 - 3 - 乙醇介导信号传导的理解，也凸显了吲哚家族 QS 信号在细菌通讯中的潜在普遍性。

此前研究已证实吲哚 - 3 - 乙醇在真菌生理学调节中起关键作用，影响真菌的菌丝发育、生物膜形成、酵母 - 菌丝转变等过程，进而影响其致病性和适应性 。在本研究中，发现吲哚 - 3 - 乙醇不仅参与细菌种内信号传导，还参与细菌间的种间通讯。鉴于细菌和真菌在自然微生物生态系统中常共存，吲哚 - 3 - 乙醇很可能也介导细菌和真菌之间的跨界通讯，其在跨界通讯和微生物生态中的作用值得进一步研究。

研究还发现，阴沟肠杆菌中的醇脱氢酶 YjgB 催化吲哚 - 3 - 乙醛转化为吲哚 - 3 - 乙醇，体内和体外实验均证实了 YjgB 在阴沟肠杆菌中合成吲哚 - 3 - 乙醇的酶活性。氨基酸序列比较显示，阴沟肠杆菌中的 YjgB 与大肠杆菌中的醇脱氢酶 YjgB 具有高度同源性，且 YjgB 在多种细菌和真菌中高度保守，这表明吲哚 - 3 - 乙醇可能是一种广泛存在于细菌和真菌类群中的高度保守的 QS 信号。

在细菌中，吲哚可能通过多种受体发挥作用，如大肠杆菌中的双组分系统 BaeSR 和 CpxAR 等 。然而，对于吲哚 - 3 - 乙醇这类吲哚衍生物在细菌系统中的具体受体大多尚未确定，这给全面阐明其信号通路和机制带来挑战。通过 BLAST 程序搜索阴沟肠杆菌中已知吲哚受体的同源物，发现了 7 个潜在的同源物，这凸显了吲哚家族 QS 信号在细菌中信号通路的复杂性。

总之，本研究揭示了吲哚 - 3 - 乙醇信号系统在多种细菌中的存在，但其中涉及的详细信号通路和调控机制仍有待进一步阐明。本研究主要聚焦于吲哚 - 3 - 乙醇在阴沟肠杆菌种内信号传导以及与宋内志贺菌种间通讯中的作用，为深入研究吲哚家族 QS 信号对致病性和微生物相互作用的调节机制奠定了基础。

材料和方法

1. 细菌菌株和生长条件：研究中使用的细菌菌株和质粒信息详细列于表格中。所有质粒和菌株均进行了测序。阴沟肠杆菌和宋内志贺菌在 LB 培养基或 LB 琼脂培养基中，37°C 培养，根据需要添加卡那霉素（100μg/mL）和氨苄青霉素（100μg/mL）。通过测量 600nm 波长处的光密度评估细菌生长情况。
2. 纯化和结构分析：培养阴沟肠杆菌 ATCC 13047 细胞，离心后用乙酸乙酯萃取上清，蒸发浓缩得到提取物，再用甲醇溶解。通过 HPLC 进行分析和进一步纯化，使用 C18 反相柱，采用不同的梯度洗脱条件。利用核磁共振光谱仪获得 1H 和 13C NMR 光谱，通过超高效液相色谱 - 电喷雾电离串联质谱（UHPLC-ESI-MS/MS）进行分析。
3. 阴沟肠杆菌突变体和互补菌株的构建：利用 λ Red 重组酶系统，以 pKD46-Tet 质粒为支撑，pKD4 质粒为模板设计引物，构建 yjgB 敲除突变体，之后用 pCP20 质粒去除卡那霉素抗性。将目标基因整合到 pBBR1-MCS2 质粒中，通过电穿孔导入阴沟肠杆菌敲除突变体，获得互补菌株。
4. 报告菌株的构建和活性测定：使用携带无启动子 luxCDABE 报告基因簇的 pMS402 质粒，通过 PCR 扩增目标启动子，并将其克隆到 pMS402 质粒的 lux 基因上游，构建启动子 - luxCDABE 报告融合体，再通过电穿孔导入阴沟肠杆菌。使用酶标仪测量启动子活性，以发光强度（每秒计数）表示。
5. 表型分析：采用 96 孔板法对阴沟肠杆菌和宋内志贺菌的生物膜进行定量分析，对细菌进行培养、稀释、接种、染色等操作后，测量 590nm 处的光密度来量化生物膜形成情况。通过在形成的生物膜上添加不同浓度的吲哚 - 3 - 乙醇处理，评估其对宋内志贺菌生物膜分散的影响。在半固体琼脂上评估细菌的运动性，测量细菌迁移痕迹的直径。通过收集培养物、离心、沉淀、干燥等步骤，对 EPS 的产生进行定量。利用乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）释放实验评估细胞毒性，用 A549 细胞进行感染实验，通过试剂盒测定 LDH 释放量，计算相对于未感染对照组的细胞毒性。
6. 蛋白质表达和纯化：通过 PCR 扩增 yjgB 编码区，克隆到表达载体 pET-28a (+) 中，转化到大肠杆菌 BL21 (DE3) 菌株中。对转化细胞进行培养、诱导表达，收集细胞后制备粗提物，再通过 HisTrap 亲和柱纯化融合蛋白，用 SDS-PAGE 分析洗脱组分。
7. 酶活性测定：以纯化的蛋白为催化剂，吲哚 - 3 - 乙醛为底物，在含有特定缓冲液和辅酶的反应体系中进行酶活性测定。反应产物通过配备 UV/Vis 检测器的 HPLC 系统进行分析，使用反相 T3 Waters 柱，设定特定的流动相和检测波长。
8. RNA-Seq 和 RT-qPCR 分析：培养细菌至特定光密度后，收集样品进行 RNA 提取、cDNA 合成和 RT-qPCR 分析，每个生物学重复设置三个技术重复，以 16S RNA 转录水平为内参，通过比较 CT 值（2-ΔΔCT 方法）计算目标基因的相对表达水平 。按照既定方案进行双链 cDNA 合成和高通量 RNA-Seq，对 RNA-Seq 数据进行分析，构建参考基因组索引，比对测序 reads，设定 q 值（错误发现率）<0.05 和倍数变化> 1 来鉴定差异表达基因，以宋内志贺菌的 hisG 基因和阴沟肠杆菌的 rpoB 基因作为内参。
9. 统计分析：实验数据以平均值 ± 标准差表示，使用 GraphPad Prism 10 软件进行统计分析，P < 0.05 被认为具有统计学意义。通过单向方差分析（one-way ANOVA）或非配对 t 检验确定统计显著性，所有实验至少重复三次，且结果相似。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（2021YFA0717003）、深圳市科技创新委员会（JCYJ20241202124801003）和深圳市医学研究基金（B2403002）的资助。Y.D. 构思了该项目，X.C.、M.W. 和 Y.D. 设计了研究方案，X.C. 和 M.W. 进行了实验研究，X.C.、M.W.、Z.Z.、X.L.、G.P.、B.C.、Q.W.、B.G. 和 Y.D. 分析了数据，X.C.、M.W. 和 Y.D. 撰写了论文，Y.D. 获得了研究经费支持。