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新冠疫情期间，益生菌对 SARS-CoV-2 感染的作用备受关注。本文通过仓鼠模型研究发现，特定益生菌组合（如含 Bifidobacterium longum LA101 等 4 种菌株的 LR 组合及 2 种 Bifidobacterium breve 菌株）能降低病毒载量、减轻炎症，促进感染后体重恢复，为新冠防治提供新方向。
引言
冠状病毒病 2019（COVID-19）由严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（SARS-CoV-2）引发，全球大流行。SARS-CoV-2 通过刺突 S1 糖蛋白附着于血管紧张素转化酶 2（ACE2）进入细胞，主要在人体上呼吸道（URT）和肺部复制，引发肺炎、肺泡损伤，还会导致胃肠道紊乱，与肠道微生物群失调有关。
益生菌在 COVID-19 防治中的应用备受关注，其依据在于能刺激黏膜免疫反应、降低肠道通透性、维持免疫稳态，部分研究表明益生菌可减轻 SARS-CoV-2 感染症状、降低病毒载量、减少呼吸衰竭和死亡风险，还能通过抗病毒干扰素途径和减少炎症反应降低肠道和呼吸道细胞的病毒感染。本研究旨在仓鼠模型中探究 14 天补充益生菌对 SARS-CoV-2 感染的预防作用，测试了两种 Bifidobacterium breve 菌株（CNCM I-5644 和 CNCM I-5979）和一种含 4 种菌株（Bifidobacterium longum LA101、Lactobacillus helveticus LA102、Lactococcus lactis LA103 和 Streptococcus thermophilus LA104）的益生菌混合物（LR）。
结果
- 体外筛选具有免疫调节特性的细菌菌株：研究发现醋酸盐在病毒感染中具有保护作用，可改善气道上皮屏障或增强抗病毒反应。研究人员测定了 20 种菌株的体外醋酸盐生成情况，11 种菌株的醋酸盐生成量显著高于阴性对照。通过测量外周血单核细胞（PBMCs）释放的 IFN-γ 和 IL-12p70 评估抗病毒活性，8 种菌株增强了 IFN-γ 生成，8 种菌株增加了 IL-12p70 生成。此外，3 种菌株在脂多糖（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞中显示出显著的抗炎活性，可降低 IL-6 水平，3 种菌株降低了 TNF-α 水平，8 种菌株诱导了 IL-10 生成。基于这些结果，选择 CNCM I-5644 和 CNCM I-5979 菌株进行体内实验。
- 补充 LR、CNCM-I 5979 或 CNCM-I 5644 可减轻 SARS-CoV-2 感染：感染 SARS-CoV-2 的仓鼠从感染后 3 天（dpi）开始体重显著下降，直至 6 - 7 dpi。补充 LR 或 CNCM-I 5979 的仓鼠在 6 - 7 dpi 开始恢复体重。CNCM-I 5979 和 CNCM-I 5644 分别在 4 dpi 显著降低了上呼吸道（URT）的病毒肺部载量和肺部病毒滴度，LR 在 4 dpi 和 7 dpi 显著降低了 URT 和肺部的病毒载量及滴度。感染 7 dpi 时，SARS-CoV-2 感染导致肺部 Ifn-γ 表达升高，只有 LR 能显著降低其表达。这些数据表明益生菌补充，尤其是 LR，可通过降低病毒滴度和载量促进感染后体重恢复。
- 益生菌调节与炎症、屏障和抗病毒反应相关的肠道基因表达：SARS-CoV-2 感染显著增加了结肠中 Ifn-I（4 dpi）、回肠中 Il-12p40（4 dpi）、回肠中 Il-6 和 Occludin（7 dpi）的转录本。LR 补充显著降低了结肠中 Ifn-I（4 dpi）和回肠中 Occludin（7 dpi）的表达，CNCM I-5979 仅降低了回肠中 Il-6（7 dpi）的表达，CNCM I-5644 分别降低了回肠中 Il-12p40（4 dpi）和 Occludin（7 dpi）的表达。CNCM I-5644 的抗炎活性与蛋白水解活性显著降低有关，其他测试的益生菌也有降低趋势但未达显著水平。这表明 SARS-CoV-2 感染引起肠道紊乱，益生菌补充可部分抵消这种影响。
- 益生菌的作用与微生物群组成和短链脂肪酸（SCFA）产生无关：SARS-CoV-2 感染期间，α 多样性无统计学变化，β 多样性图显示按处理和时间点聚类。感染仓鼠的微生物群在属水平上，Ligilactobacillus 和 Muribaculum 水平显著降低，Dubosiella、Bifidobacterium 等水平显著升高。感染仓鼠的粪便 SCFA 除 4 dpi 有下降趋势（7 dpi 消失）外，无重大变化。补充益生菌未显著改变感染仓鼠的微生物群和 SCFA 产生。Spearman 相关性分析确定 Prevotellaceae_UCG_001、Ligilactobacillus 等与病毒拷贝数呈负相关，Muribaculum 还与肺 Ifn-γ 和回肠 occludin 呈负相关，与回肠 Il-6 呈正相关。
讨论
自 COVID-19 大流行以来，营养补充剂（如维生素、矿物质和益生菌）受到广泛关注，但益生菌对 SARS-CoV-2 的体内抗病毒活性证据仍然有限。本研究在 SARS-CoV-2 仓鼠模型中评估了两种体外筛选的菌株和一种商业益生菌混合物（LR）的效果。
补充 LR 的仓鼠体重恢复更快，LR 在 4 - 7 dpi 对 URT 和肺部的病毒载量和滴度有最佳的降低效果，还能降低肺部 Ifn-γ 水平，且这种效果并非通过降低 ACE2 表达实现，可能涉及其他机制，如细菌素与 RNA 依赖性 RNA 聚合酶（RdRp）、SARS-CoV-2 受体结合域（RBD）和 ACE2 的结合，以及 IgM 和 IgG 的参与等，未来可进一步研究细胞毒性免疫和 Ig 相关免疫来揭示益生菌的作用机制。
CNCM I-5644 和 CNCM I-5979 对肺部感染的影响较小，但能改善肠道炎症和通透性，CNCM I-5644 还可降低粪便蛋白水解活性，解释了其对肠道生理的改善作用。
微生物群和 SCFA 的变化与先前研究中疾病严重程度相关的改变一致，感染仓鼠中一些已知具有免疫调节潜力的属增加，而 Muribaculaceae 和 Muribaculum 减少，后者能产生 SCFA 并诱导适应性免疫反应。本研究中益生菌未能恢复肠道微生物群平衡和 SCFA 浓度，表明其可能直接作用于肠 - 肺轴，而不影响肠道微生物群，但不能排除对未评估的肺部微生物群的影响。
总之，本研究确定了两种菌株和一种益生菌混合物能够减轻仓鼠的 SARS-CoV-2 感染，尽管作用机制有待进一步研究，但已表明测试的益生菌，尤其是混合物，有助于控制肺部炎症和改善肠道屏障，促进快速恢复。
材料和方法
- 体外筛选 20 种细菌菌株的免疫调节特性
- PBMCs 实验：使用来自 5 名健康男性供体（年龄 < 65 岁，体重指数 < 30，HIV、乙肝病毒阴性）的人 PBMCs，按照先前方法进行实验。将细菌与 PBMCs 共孵育 48 小时后，通过 ELISA 定量细胞因子。
- 巨噬细胞 RAW 264.7 细胞系实验：购买小鼠巨噬细胞 RAW 264.7 细胞系，在含 10% 热灭活胎牛血清（FBS）和 1% 谷氨酰胺的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养。实验时，将细菌以 1:40 的感染复数加入细胞，同时用大肠杆菌 O111:B4 的 LPS（100 ng/mL）刺激 24 小时，最后通过 ELISA 试剂盒检测 IL-6、IL-10 和 TNF-α 浓度。醋酸盐测量方法见 SCFA 生成部分。
- 体内实验
- 实验步骤：选用 8 周龄雌性叙利亚金黄地鼠，随机分为 5 组（每组 16 只）：非感染（NI）给予口服磷酸盐缓冲液（PBS）组（NI-PBS）、感染给予口服 PBS 组（IN-PBS）、感染给予益生菌混合物（LR）组（IN-LR）、感染给予 CNCM-I 5979 菌株组（IN-I 5979）、感染给予 CNCM-I 5644 菌株组（IN-I 5644）。感染前 7 天至感染后 7 天每天称量动物体重，分别在 4 dpi 和 7 dpi 对每组 8 只动物进行解剖，收集全血、血浆、肺、URT、回肠、结肠和粪便样本并保存。
- 病毒载量和滴定：在 90% 汇合的 Vero-E6 细胞 96 孔板上进行滴定，使用 Spearman-K?rber 方法计算病毒滴度。提取肺 RNA，通过 TaqMan RT-qPCR 检测包膜蛋白基因（E 基因），使用标准曲线进行绝对定量。
- SCFA 生成：采用气相色谱（GC）测定粪便样本中的 SCFA 含量。粪便样本经水提取、离心、去蛋白后，取上清液进行 GC 分析，以 2 - 乙基丁酸为内标，10 mM 的 SCFA 面板为技术对照，所有样本均重复分析。
- 微生物群分析：收集 4 dpi 和 7 dpi 的粪便样本，提取微生物 DNA，使用通用引物扩增细菌 16S rRNA 基因的 V3 - V4 区域，通过 Illumina NovaSeq PE250 平台测序。原始序列经 FROGS 流程分析，通过 BLAST 比对 SILVA 138 16S 数据库进行分类，过滤后构建系统发育树，使用 MicrobiomeAnalyst 2.0 进行后续统计分析，计算 Chao1 和 Shannon 指数评估 α 多样性，进行主坐标分析和 PERMANOVA 分析评估 β 多样性。
- 粪便蛋白酶活性：以偶氮酪蛋白为蛋白水解底物，通过光度法测定粪便蛋白酶活性。将粪便样本与反应缓冲液混合、离心，取上清液与偶氮酪蛋白溶液孵育，终止反应后再次离心，测量 450 nm 处的吸光度。
- RNA 提取和 RT-qPCR：提取总 RNA 并合成 cDNA，反应混合物包含特定试剂和引物，以叙利亚地鼠 IFN-γ TaqMan 和 β-actin 为内参，使用 2-ΔΔCT 方法计算相对表达量。
- 统计分析：结果以平均值 ± 标准误表示，对正态样本进行单因素方差分析（ANOVA），使用 Dunnett 检验进行多重比较；对非正态样本进行非参数检验（Kruskal-Wallis 检验），使用 Dunn 检验进行多重比较，使用 GraphPad Prism 9 软件，α 水平设定为 0.05。
致谢
研究人员感谢 Jonathan Rieder、Mélanie Badré-Biarnais 等在病毒学、血清学、生化分析以及动物护理和实验方面的贡献，还感谢 Claude Blondeau 对稿件的校对。
