REL/DPA/AVI 法：基于光密度从阳性血培养中快速检测产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的新突破

碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌（CRE）死亡率高，早期精准检测意义重大。本文介绍的 REL/DPA/AVI 法，能从阳性血培养中快速鉴别产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌（CPE），相比传统方法耗时更短、成本更低，为临床诊疗提供有力支持。

　　

一、研究背景

自青霉素用于治疗细菌感染以来，抗生素的频繁和过度使用导致了抗菌药物耐药性（AMR）问题，这已成为潜在的公共卫生危机。碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌（CRE）是全球最重大的威胁之一，在世界卫生组织更新的细菌重点病原体目录中占据重要位置。肠杆菌科细菌在血流感染（BSI）中的检测频率高达 35.1%，且呈持续上升趋势。由 CRE 引起的 BSI 死亡率通常在 29% - 46.2% 之间，是碳青霉烯敏感革兰阴性菌（CS - GNB）引起 BSI 死亡率的 2.1 - 3.3 倍。多项研究表明，对于 BSI 患者，血培养 12 小时或菌血症 48 小时后延迟给予适当的抗生素治疗，会增加患者 30 天死亡率。

目前，快速的物种鉴定技术如基质辅助激光解吸 / 电离飞行时间质谱（MALDI - TOF MS）虽能从阳性血培养中直接鉴定细菌种类，但在优化抗菌治疗方面仍显不足，尤其是涉及碳青霉烯耐药时，因其可能涉及多种耐药机制。产碳青霉烯酶是 CRE 的重要耐药机制之一，不同类型的碳青霉烯酶需要不同的治疗方案，因此快速鉴定和区分碳青霉烯酶对优化治疗、改善患者预后、控制 CRE 传播和促进抗菌药物管理至关重要。

当前，产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌（CPE）的检测主要分为表型检测和基因型检测。传统的表型检测方法如改良碳青霉烯灭活法（mCIM）、乙二胺四乙酸（EDTA）碳青霉烯灭活法（eCIM）以及中国专家共识推荐的 3 - 氨基苯基硼酸（APB）和 EDTA 联合法（APB - EDTA 法），虽具有成本低、特异性高的特点，但需要过夜孵育，血培养阳性后至少需要 48 小时才能得出结果。Carba NP 虽能在 2 小时内提供结果，但对低活性的 OXA - 48 敏感性较低（56%）。聚合酶链反应（PCR）检测具有高灵敏度、特异性和速度快的优点，可直接用于临床样本检测，但成本高，需要特殊设备和专业人员，且无法识别新的或突变的基因型。此外，一些新型检测技术如 Volland 开发的 BL - DetecTool 设备，虽能进一步缩短检测时间，但只能检测五种主要的碳青霉烯酶（NDM、KPC、IMP、VIM 和 OXA - 48 样），无法识别一些罕见或突变的基因型。基于碳青霉烯酶活性的表型方法理论上可检测几乎所有类别的碳青霉烯酶及其变体，因此本研究旨在开发一种基于靶向碳青霉烯酶表型检测的新方法。

二、材料与方法

1. 细菌分离株：本研究共纳入 213 株肠杆菌科细菌，其中 209 株临床分离株来自南昌大学第二附属医院和上海肺科医院的多种临床标本（痰液、血液、尿液和伤口分泌物），另外 4 株为参考菌株，包括肺炎克雷伯菌 ATCC BAA - 1705（产 KPC 碳青霉烯酶）、肺炎克雷伯菌 ATCC BAA - 2146（产 NDM 碳青霉烯酶）、肺炎克雷伯菌 ATCC BAA - 2524（产 OXA - 48 碳青霉烯酶）和肺炎克雷伯菌 ATCC BAA - 1706（碳青霉烯酶阴性）。通过 PCR 初步鉴定所有分离株的碳青霉烯酶基因，并经 DNA 测序验证。根据结果将其分为 CPE 组（n = 137）和非产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌组（n = 76）。CPE 组包含中国主要流行的碳青霉烯酶基因型，如 A 类碳青霉烯酶（n = 41，KPC）、B 类碳青霉烯酶（n = 82，NDM、IMP 和 NDM + IMP）、D 类碳青霉烯酶（n = 7，OXA - 48、OXA - 181 和 OXA - 232）以及同时产生两种不同碳青霉烯酶的菌株（n = 7，KPC + NDM 和 KPC + IMP）。非产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌组包括碳青霉烯敏感肠杆菌科细菌（CSE）和碳青霉烯非敏感肠杆菌科细菌（CNSE），CSE 定义为对亚胺培南、美罗培南和厄他培南完全敏感的分离株，CNSE 定义为对这些碳青霉烯类药物表现出中介敏感性或耐药性的分离株。所有参考菌株购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），分离株保存在 - 80°C 的冻存管中，检测前复苏并传代培养。使用 MALDI - TOF MS（VITEK MS IND MALDI TOF，bioMérieux）进行菌种鉴定，以大肠杆菌参考菌株 ATCC 8739 作为质量控制菌株。采用肉汤微量稀释法（BMD）根据临床和实验室标准协会（CLSI）指南测定亚胺培南（Solarbio Science & Technology [Beijing] Co., Ltd.）、美罗培南（Solarbio Science & Technology [Beijing] Co., Ltd.）和厄他培南（Shanghai Yuanye Bio - Technology Co., Ltd.）的最低抑菌浓度（MIC），耐药分离株（MIC ≥ 4 mg/L）的最高测试浓度设定为 512 mg/L，非耐药分离株（MIC < 4）的最高测试浓度设定为 256 mg/L，以铜绿假单胞菌 ATCC 27853 和大肠杆菌 ATCC 25922 作为质量控制菌株。
2. 阳性血培养的制备：将在哥伦比亚琼脂平板（Thermo Fisher Scientific Biochemical Products [Beijing] Co., Ltd., Beijing, China）上培养过夜的细菌菌落调整至 0.5 麦氏浊度的 0.9% 氯化钠溶液（Jiangxi Kerun Pharmaceutical Co., Ltd.）中，稀释 1000 倍。取 1 μL 稀释后的细菌悬液加入含有 500 μL 0.9% 氯化钠溶液的注射器中，使细菌浓度达到 300 CFU/mL，然后接种到含有无菌人血（Remel, Santa Fe Trail Drive, Lenexa, KS, USA）的需氧血培养瓶中。接种后，血培养瓶在 VersaTREK 自动微生物检测系统（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）中孵育。血培养瓶阳性后，取 100 μL 血培养液接种到哥伦比亚琼脂平板上，检查阳性信号的纯度。
3. 确定判定时间：随机选取 25 株肠杆菌科细菌，包括肺炎克雷伯菌（n = 5；1 株临床分离株 + 4 株参考菌株：肺炎克雷伯菌 ATCC BAA - 1705、肺炎克雷伯菌 ATCC BAA - 2146、肺炎克雷伯菌 ATCC BAA - 2524 和肺炎克雷伯菌 ATCC BAA - 1706）、大肠杆菌（n = 5；临床分离株）、阴沟肠杆菌复合体（n = 5；临床分离株）、产气克雷伯菌（n = 5；临床分离株）和产酸克雷伯菌（n = 5；临床分离株），按照上述方法制备阳性血培养。取阳性血培养后的培养液 10 mL，置于 15 mL 无菌离心管中，1500 rpm（~403 × g）离心 5 分钟，沉淀红细胞和碎片。上清液再以 2500 rpm（~1118 × g）离心 10 分钟，浓缩细菌。弃去上清液，加入 0.5 mL（根据细菌沉淀量调整）LB 肉汤（Solarbio Science & Technology [Beijing] Co., Ltd.）重悬底部的白色细菌沉淀（若有红色沉淀，尽量只重悬上层白色细菌沉淀）。将重悬后的沉淀在 LB 肉汤中调整至 2 麦氏浊度的细菌悬液备用。取 1 mL 该重悬液分别加入 4 个 5 mL 试管中：试管 1 含 3 mL LB 肉汤；试管 2 含 3 mL LB 肉汤、3.2 μL 5 mg/mL 亚胺培南和 3.2 μL 10 mg/mL 瑞来巴坦（Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.）；试管 3 含 3 mL LB 肉汤、3.2 μL 5 mg/mL 亚胺培南和 100 μL 5 mg/mL 吡啶二羧酸（DPA，Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.）；试管 4 含 3 mL LB 肉汤、3.2 μL 5 mg/mL 亚胺培南和 6.4 μL 10 mg/mL 阿维巴坦钠（Solarbio Science & Technology [Beijing] Co., Ltd.）。每个试管中最终细菌接种量约为 1.5 × 10⁸ CFU/mL（0.5 麦氏标准），亚胺培南浓度为 4 mg/L。对于 4 株肺炎克雷伯菌参考菌株，在原有 4 个试管的基础上再额外设立 3 个试管，使用相同的重悬参考菌株沉淀，以观察 β - 内酰胺酶抑制剂对细菌生长的影响：试管 5 含 3 mL LB 肉汤和 3.2 μL 10 mg/mL 瑞来巴坦；试管 6 含 3 mL LB 肉汤和 100 μL 5 mg/mL DPA；试管 7 含 3 mL LB 肉汤和 6.4 μL 10 mg/mL 阿维巴坦钠。将试管置于振荡培养箱（Changzhou JTLIANGYOU Instrument Co., Ltd.）中，37°C、200 rpm 振荡培养，每 0.5 小时测量一次光密度变化（OD_630nm，每孔 200 μL），以确定最早的判断时间，这些条件即为最终优化的测试条件。
4. 使用 REL/DPA/AVI 法检测临床分离株：按照上述方法为所有分离株制备阳性血培养。通常取 1 mL 重悬液加入试管 1 - 4 中，37°C、200 rpm 振荡培养。以 1 小时和 1.5 小时的光密度作为判断依据，通过受试者工作特征（ROC）曲线确定区分细菌生长（细菌产生的碳青霉烯酶类型未被试管中添加的酶抑制剂抑制）和抑制（细菌产生的碳青霉烯酶类型被试管中添加的酶抑制剂抑制）状态的临界光密度值。根据获得的临界值，生长记为 “+”，抑制记为 “ - ”。以下解释被认为是有效的：试管 1 和 3 为 “ + ”，而试管 2 和 4 为 “ - ”，表明分离株可能产生 A 类碳青霉烯酶（KPC、GES 和 IMI）；试管 1、2 和 4 为 “ + ”，试管 3 为 “ - ”，表明分离株可能产生 B 类碳青霉烯酶（NDM、IMP 和 VIM）；试管 1、2 和 3 为 “ + ”，试管 4 为 “ - ”，表明分离株可能产生 D 类碳青霉烯酶（OXA - 48、OXA - 181 和 OXA - 232）；试管 1 为 “ + ”，其余试管为 “ - ”，表明分离株可能碳青霉烯酶阴性；若所有 4 个试管均为 “ + ”，分离株可能同时产生多种类型的碳青霉烯酶或碳青霉烯酶阴性（表明存在非酶介导的亚胺培南耐药机制），需要进一步确认。值得注意的是，如果试管 1 被判断为 “ - ”，则结果无法解释。
5. REL/DPA/AVI 法的方法学比较：采用 CLSI 和中国专家共识推荐的碳青霉烯酶表型检测方法，即 mCIM/eCIM 和 APB - EDTA 法，对 CNSE 进行酶分型，并与 REL/DPA/AVI 法进行比较分析。所有实验严格按照 CLSI 指南和中国专家共识进行。根据中国专家共识推荐，APB - EDTA 法使用含有终浓度为 300 μg / 片 APB 和 292 μg / 片 EDTA 的亚胺培南药敏纸片（Oxoid, UK）。以肺炎克雷伯菌 ATCC BAA - 1705、肺炎克雷伯菌 ATCC BAA - 2146、肺炎克雷伯菌和肺炎克雷伯菌 ATCC BAA - 1706 作为质量控制菌株。结果解释标准如下：当添加 APB 和 APB 与 EDTA 组合的亚胺培南药敏纸片周围抑菌圈直径相比未添加任何物质的纸片增加≥5 mm，而在其他情况下增加 < 5 mm 时，判定为 A 类碳青霉烯酶；当添加 EDTA 和 APB 组合的亚胺培南药敏纸片周围抑菌圈直径相比未添加任何物质的纸片增加≥5 mm，而在其他情况下增加 < 5 mm 时，结果判定为不确定（非 A 非 B 类碳青霉烯酶）；在本研究中，抑菌圈直径≥23 mm 时，判定为碳青霉烯酶阴性。对于 mCIM 实验，按照 CLSI 指南，将美罗培南药敏纸片（Oxoid, UK）浸入接种有 1 μL 肠杆菌科细菌的 2 mL 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，35°C 孵育 4 小时后，转移至接种有大肠杆菌 ATCC 25922 的 Mueller - Hinton 琼脂平板上，35°C 过夜孵育。eCIM 实验在含有 1 μL 肠杆菌科细菌的 TSB 中额外加入 20 μL 0.5 M EDTA（终浓度 5 mM），其他步骤与 mCIM 相同。结果严格按照 CLSI 指南解释，分别以肺炎克雷伯菌 ATCC BAA - 1705 和肺炎克雷伯菌 ATCC BAA - 1706 作为阳性和阴性对照。
6. 统计分析：使用社会科学统计软件包（版本 20.0）进行数据分析。数据进行正态性检验，符合正态分布的数据以均值 ± 标准差表示，不符合正态分布的数据以四分位数间距（IQRs）表示。根据数据是否符合正态分布，使用 Mann - Whitney U 检验或 Student's t检验比较组间差异。使用 ROC 曲线确定最佳临界值，使用 MedCalc（https://www.medcalc.org/）计算灵敏度、特异性、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）。使用 R 版本 4.4.2 和 GraphPad Prism 10.1.2 创建统计图表，P < 0.05 为差异具有统计学意义。

三、结果

1. REL/DPA/AVI 法的原理：REL/DPA/AVI 法在含有亚胺培南、特定碳青霉烯酶抑制剂和 LB 肉汤的鉴定管中快速孵育细菌，通过监测光密度变化来确定酶的类型。采用差速离心法从阳性血培养中分离出大部分红细胞和碎片，浓缩细菌并保留其生物活性。鉴定管的配置如下：试管 1 仅含 LB 肉汤，用于评估分离细菌的活力；试管 2 在 LB 肉汤中加入瑞来巴坦和亚胺培南，瑞来巴坦用于抑制细菌产生的 A 类碳青霉烯酶；试管 3 在 LB 肉汤中加入 DPA 和亚胺培南，DPA 用于抑制细菌产生的 B 类碳青霉烯酶；试管 4 在 LB 肉汤中加入阿维巴坦钠和亚胺培南，阿维巴坦钠可抑制测试菌株产生的 A 类和 D 类碳青霉烯酶（OXA - 48、OXA - 181 和 OXA - 232）。在 37°C、200 rpm 快速孵育后，1 小时测量光密度，1.5 小时直接肉眼观察浊度，以评估每个鉴定管中细菌的生长情况，从而确定测试菌株产生的碳青霉烯酶类型。
2. 判定时间：为了研究在含有不同碳青霉烯酶抑制剂的试管中肠杆菌科细菌生长状态（生长与抑制）的早期区分，对 25 株肠杆菌科细菌进行了时间序列分析，包括三种不同类型的碳青霉烯酶阳性和一株碳青霉烯酶阴性的肺炎克雷伯菌参考菌株。通过测量这些菌株在四个鉴定管中随时间的光密度变化，确定最早区分肠杆菌科细菌生长状态的时间点。结果表明，在 0.5 小时的孵育阶段，酶抑制剂显著抑制了抑制管中的细菌生长，与生长管相比光密度差异显著（P < 0.001）。但由于孵育时间短和亚胺培南发挥作用需要时间，生长管和抑制管之间的光密度差异较小。随着孵育时间延长至 1 小时，细菌繁殖速率增加和亚胺培南的作用使差异进一步增大（P < 0.001）。值得注意的是，1.5 小时的孵育时间足以通过肉眼区分试管中的生长和抑制