首次揭秘猪圆环病毒 3 型（PCV3）：拯救、致病机制与免疫影响

这篇研究成功拯救了猪圆环病毒 3 型（PCV3），借助透射电镜首次清晰观察到其病毒粒子。通过感染剖宫产仔猪（CD 猪），深入揭示了 PCV3 的致病机制，发现其对免疫细胞的影响，为疫苗研发和猪病防控提供关键依据。

　　

引言

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）属于圆环病毒科圆环病毒属，是一种环状单链 DNA 病毒，包括 PCV1 - 4。目前对 PCV2 的致病机制研究较多，但对 PCV3 的研究较少。PCV3 于 2016 年被发现，其基因组约 2000 nt，包含三个主要开放阅读框（Open Reading Frames，ORFs）：ORF1、ORF2 和 ORF3 。该病毒在全球传播迅速，不仅在猪身上检测到，在犬科及其他哺乳动物中也有发现。有研究认为 PCV3 可能起源于蝙蝠，鸟类可能是重要的中间宿主，存在跨物种传播风险，影响公共卫生安全。

PCV3 可垂直传播，穿越胎盘屏障在胎儿组织中复制，导致怀孕母猪出现死胎、木乃伊胎等情况。持续的病毒血症增加了其传播风险，且在不同阶段的猪体内都能检测到，其中木乃伊胎中的病毒载量最高，表明其可能与繁殖障碍有关。此外，PCV3 感染还可能导致猪的免疫抑制，降低免疫反应。目前，从临床样本中分离和纯化 PCV3 面临挑战，因此，利用感染性克隆拯救 PCV3 是一种有价值的替代方法。单细胞 RNA 测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技术在病原体研究中应用广泛，有助于深入了解 PCV3 感染后的免疫反应机制。

材料和方法

1. 重组质粒的构建：将 PCV3 全长基因组（GenBank：PP196470.1）通过 EcoRI 和 SpeI 限制性酶切位点插入到 pBluescript II SK+（pSK）载体中，确保插入方向与载体复制原点（Ori）匹配，构建的重组质粒命名为 pSK-PCV3，并通过基因测序和 NCBI 数据库中的 BLAST 进行鉴定。
2. 拯救原始 PCV3：用 pSK-PCV3 转染 PK-15 细胞并连续传代。转染时，将 PK-15 细胞接种于六孔板，待细胞汇合度达到约 80% ，弃去上清，用无菌 PBS 洗涤细胞单层 3 次，加入 1 mL 不含青霉素 / 链霉素和血清的 DMEM 培养基，在 5% CO₂、37°C 条件下孵育。将 4 μL Lip2000 转染试剂和 4 μg pSK-PCV3 重组质粒分别与 50 μL DMEM 混合，孵育 5 min 后混合均匀，再孵育 20 min，然后加入到准备好的 PK-15 细胞单层上。4 h 后，加入 1 mL 完全生长培养基，继续孵育 24 - 48 h 后进行细胞传代。
3. 间接免疫荧光分析（IFA）：对转染细胞进行检测时，将携带病毒的细胞连续传代 3 次后接种到 96 孔板，孵育 12 h 后固定进行免疫荧光检测，以转染空载体的 PK-15 细胞作为阴性对照。对感染细胞进行检测时，以未感染的 PK-15 细胞作为阴性对照，以感染野生型 PCV3（wPCV3）的 PK-15 细胞作为阳性对照，感染拯救的 PCV3 的 PK-15 细胞作为实验组。分别用病毒拷贝数为 1×10⁸的 PCV3 和 wPCV3 感染 PK-15 细胞，在感染后 24、36 和 48 h 进行检测。检测时，弃去上清，用 4% 多聚甲醛固定细胞 20 min，然后用含 0.05% 吐温 20 的磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤 3 次，每次 5 min。用 0.5% Triton-X-100 在室温下处理细胞 20 min，再用 PBST 洗涤 3 次。加入实验室制备的单克隆抗体 2E6，4°C 孵育过夜。用 PBST 洗涤 3 次后，加入荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的小鼠二抗（Cell Signaling Technology），37°C 孵育 1 h。弃去二抗溶液，每孔加入 50 μL 4',6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚（DAPI）染色 5 min，室温下用 PBST 洗涤 3 次，最后用荧光显微镜观察细胞。
4. 蛋白质免疫印迹分析（Western blot）：收集转染真核质粒 pCAGGS-PCV3-Cap（实验室保存）的 PK-15 细胞作为阳性对照。用单克隆抗体 2E6 作为一抗，辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠抗体作为二抗，检测携带病毒的 PK-15 细胞第三代中 PCV3-Cap 蛋白的表达。
5. 基因组拷贝数测定：构建含有编码 PCV3-Cap 蛋白的 ORF2 基因的重组质粒，扩增引物序列为：正向引物 TTAGAGAACGGACTTGTAACGAATC，反向引物 ATGAGACACAGAGCTATATTC。将 PCV3-ORF2 全长基因连接到 T 载体并测序确认，构建重组质粒。用 K5500 微量分光光度计测定质粒浓度，计算出质粒拷贝数为 4.8×10¹¹ copies/μL 。以浓度范围为 4.8×10⁹ - 4.8×10¹ copies/μL 的标准质粒为模板，进行实时荧光定量 PCR 扩增，熔解温度（Tm）为 57°C，建立标准曲线，根据标准曲线确定病毒基因组拷贝数（gc）。
6. 病毒生长动力学曲线：为确定病毒生长动力学，在携带病毒的传代细胞感染后 12、24、36、48、60 和 72 h 测量病毒拷贝数。收集的样本用 DNA 酶在 37°C 处理 30 min，以减少原质粒的潜在污染。提取细胞中的 RNA 并逆转录为 cDNA，用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）对病毒拷贝数进行定量，准确测量感染细胞中的病毒基因组数量，绘制病毒生长曲线，表征病毒随时间的复制动态。
7. PCV3 的增殖：用二甲基亚砜（DMSO）将诺考达唑（Nocodazole，Absin Biotechnology）配制成 1 mM 的储备液，工作浓度分别为 10 μM、20 μM 和 30 μM。为排除诺考达唑处理后细胞活力变化对 PCV3 增殖的影响，用细胞计数试剂盒 - 8（CCK-8）检测药物处理后的细胞活力。实验分组包括对照组、DMSO 组和诺考达唑处理组。细胞转染后，当汇合度达到 70% 时，用不同工作浓度的诺考达唑处理细胞 4 h，更换培养基后继续培养 24 h，收集细胞提取 DNA 以确定病毒拷贝数，制备蛋白质裂解物，进行蛋白质免疫印迹分析检测 Cap 蛋白表达。
8. PCV3 与 wPCV3 感染特征比较：wPCV3 是实验室先前分离、鉴定和保存的 PCV3 阳性样本，该样本中仅 PCV3 检测呈阳性，其他病原体检测为阴性。将样本匀浆并测定病毒拷贝数，分别用病毒拷贝数为 1×10⁸的 PCV3 和 wPCV3 感染 PK-15 细胞，在感染后的不同时间点进行 IFA 观察感染细胞，并计算病毒拷贝数。
9. CD 猪感染实验：选取 8 只 28 日龄 PCV 阴性的剖宫产仔猪（Cesarean-derived pigs，CD 猪），随机平均分为感染组和对照组。感染组通过滴鼻和右颈部三角肌肌肉注射接种，每头仔猪接种剂量为 5×10¹¹ copies，每个鼻孔接种 2 mL，肌肉注射 1 mL，对照组接种等量无菌 DMEM。感染组使用的病毒接种物为成功拯救的 PCV3。
10. 抗体检测：建立阻断酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测 PCV3，以原核系统表达的 PCV3-Cap 作为包被抗原，2E6 单克隆抗体作为检测抗体。当抑制率（Percentage inhibition，PI）≥28.30% 时，结果判定为阳性。在感染后 7、14、21、28 和 35 d 检测血清。
11. 免疫组织化学染色：免疫组织化学染色过程包括多个关键步骤。首先将组织固定在福尔马林溶液中以保存其结构，然后切成薄片。用二甲苯进行脱石蜡处理，通过梯度乙醇系列（100%、95%、85% 和 70%）进行水化，将切片置于抗原修复液（柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0）中，95°C 加热 20 min 以暴露抗原位点。用 5% 牛血清白蛋白（BSA）在室温下孵育 30 min 封闭非特异性结合。以 1:1000 稀释的 2E6 单克隆抗体作为一抗，4°C 孵育过夜。用 PBS 洗涤后，以 1:500 稀释的生物素化二抗（山羊抗小鼠 IgG）在 37°C 孵育 30 min。用 3,3'- 二氨基联苯胺（DAB）作为显色底物显示抗原 - 抗体复合物。用苏木精进行复染，然后依次用浓度递增的乙醇（75%、85%、95% 和 100%）脱水，用二甲苯透明，最后用中性树胶封片，在显微镜下观察。
12. 外周血单个核细胞（PBMC）增殖试验：在感染后 14 和 28 d，通过前腔静脉从实验猪采集 5 - 10 mL 无菌血液样本，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝。用猪 PBMC 分离培养基通过密度梯度离心法分离 PBMC。将分离的 PBMC 以 2×10? cells/well 的密度接种到 96 孔细胞培养板上，在 37°C、5% CO₂培养箱中孵育 4 h，然后用昆虫细胞表达并保存于实验室的 Cap 蛋白衍生的病毒样颗粒（VLPs）刺激，终浓度为 5 μg/mL。以刀豆蛋白 A（Concanavalin A，ConA）作为阳性对照，终浓度为 5 μg/mL。将 96 孔板在 37°C、5% CO₂培养箱中孵育 72 h，孵育结束后加入 CCK-8 试剂，测量 450 nm 处的吸光度（OD₄₅₀）值，计算刺激指数（Stimulation Index，SI）。
13. 10× scRNA-seq 样本制备：在 PCV3 感染后第 14 d，用 EDTA 抗凝管采集对照组和感染组的血液样本。用猪 PBMC 分离试剂盒（Solarbio）分离 PBMC，细胞活力约为 90%。随后将细胞密度调整为 1×10⁶ cells/mL，使用 10× Genomics v.3 试剂盒（10× Genomics，美国）制备高质量单细胞悬液。单细胞封装、互补 DNA（cDNA）文库合成、RNA 测序和数据分析由北京天根生化科技有限公司完成。
14. 10× scRNA-seq 数据分析：原始 scRNA-seq 数据用 Cell Ranger 软件（10× Genomics）进行比对、过滤和标准化。将映射到转录组的读数用于唯一分子标识符（Unique Molecular Identifier，UMI）计数。Cell Ranger 分析结果包括读数和 UMI 信息，使用 Seurat 软件提取表达数据，进行单细胞表达聚类和基因表达水平分析。此外，还可整合多个样本的数据进行比较。利用 Seurat 的 t 分布随机邻域嵌入（t-SNE）或均匀流形近似和投影（UMAP）对数据集进行可视化和探索，其他数据分析，如标准化、差异基因表达分析和标记基因选择，也通过 Seurat 软件实现。
15. 统计分析：用 GraphPad Prism 8.0 软件对数据进行分析，结果以平均值 ± 标准差（means ± SDs）表示。采用配对 t 检验和单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计比较，当P < 0.05、P < 0.01 和**P* < 0.001 时，认为数据具有统计学意义。

结果

1. PCV3 的鉴定和生长动力学：用 pSK-PCV3 转染 PK-15 细胞后，在转染 48 h 进行第一次传代，此时细胞中存在 PCV3 病毒粒子，后续传代的细胞为携带病毒的细胞传代。第一代传代获得的病毒上清液标记为 P1，依此类推。本研究收集第三代传代（P3）后的病毒样本，用 DNA 酶在 37°C 处理 30 min 以减少原质粒污染，使用 PCV3 特异性单克隆抗体进行鉴定。IFA 结果显示，仅在细胞核中观察到特异性荧光。蛋白质免疫印迹分析表明，与 mock 转染细胞相比，检测到了特异性的 Cap 蛋白。透射电镜观察发现，PCV3 病毒粒子呈球形，直径约 20 nm。通过测量携带病毒的传代细胞在 12、24、36、48、60 和 72 h 的病毒拷贝数，绘制生长动力学曲线，结果显示在 36 h 时病毒拷贝数最高，表明此时病毒复制达到高峰。
2. PCV3 基因组拷贝数测定：提取携带 PCV3 病毒的 PK-15 细胞的总 DNA 作为模板，用特异性引物进行 PCR 扩增，结果表明 PCV3 能够在细胞内持续存在至 25 代。以 ORF2 基因进行绝对定量 PCR，确定标准曲线为 y = - 3.3342x + 41.851，相关系数（R2）为 0.9989，实时荧光定量 PCR 可检测到低至 4.8 copies/μL 的病毒拷贝数。从第三代开始测定 PCV3 的拷贝数，随着细胞连续传代，病毒拷贝数从 1.2×10¹¹ copies/mL 逐渐降至 1.2×10³ copies/mL，表明成功拯救了 PCV3 病毒，但该病毒在 PK-15 细胞内无法有效增殖。
3. PCV3 增殖：诺考达唑处理后，用 CCK-8 测定细胞活力，结果显示药物处理组与未处理组细胞活力无显著差异（P > 0.05）。与对照组相比，药物处理组的病毒滴度和 Cap 蛋白表达呈剂量依赖性显著降低（P < 0.01），表明 PCV3 复制依赖于细胞内微管聚合。用 PCV3 和 wPCV3 感染 PK-15 细胞后，IFA 观察到感染细胞的细胞质均出现荧光。感染后不同时间点病毒基因组拷贝数的定量分析显示，随着感染时间延长，病毒拷贝数呈下降趋势，表明两种病毒感染特征相似，且在 PK-15 细胞内均无法增殖。
4. PCV3 感染 CD 猪：与对照组相比，感染组仔猪被毛粗糙，但未观察到其他明显临床症状。在 PCV3 攻毒 35 d 后，对两组仔猪实施安乐死，检查组织器官是否存在病理损伤，并采集各种样本进行后续实验分析。感染组仔猪出现轻度间质性肺炎、轻微肺水肿和脾脏轻度萎缩，其他器官未见明显病变。感染组脾脏器官指数（脾脏重量与体重的比值）比对照组降低了 0.46 g/kg，对照组所有器官均正常。记录感染后 1 d 和 35 d 的体重，计算平均日增重（Average Daily Gain，AWG），结果显示感染组 AWG 比对照组低 70 g/d，两组体温无显著差异。抗体检测结果显示，感染后 28 d 内未检测到抗体，至 35 d 时抗体呈弱阳性，阻断率为 28.58%，而对照组在整个研究期间抗体水平均为阴性。

感染组在感染后 7 d 首次检测到病毒血症，14 d 达到高峰，并持续维持在较高水平直至实验结束，对照组 PCV3 检测始终为阴性。在感染组的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和淋巴结中均检测到 PCV3，其中淋巴结中的病毒载量最高。组织病理学检查显示，与对照组相比，感染组肺部间质性肺炎更明显，肺泡间隔增厚；淋巴结中淋巴细胞数量减少，出现核浓缩；肝脏有广泛的化脓性炎性细胞浸润；肠道杯状细胞数量增加。对照组器官未观察到明显病理变化。免疫组织化学分析显示，在心脏、肝脏、肺脏、淋巴结、脾脏和肠道细胞的细胞质和细胞核中存在棕色的 PCV3 特异性点状沉积物，表明这些组织中存在 PCV3 抗原。用 ConA 和含有昆虫细胞表达的 PCV3-Cap 蛋白的 VLPs 刺激 PBMC，计算刺激指数（SI）。结果显示，ConA 刺激后，感染组和对照组细胞增殖无显著差异；但用 VLP-PCV3-Cap 刺激后，细胞增殖受到抑制，两组间差异显著（P < 0.05），且感染组抑制作用更明显。
5. scRNA-seq：使用 10× Genomics 平台