MEX-5 驱动体外 PGL-3/RNA 凝聚物分解的机制：解析细胞命运调控的关键环节

本文聚焦于秀丽隐杆线虫胚胎中 P 颗粒的形成与溶解机制，发现 MEX-5 可通过改变 RNA 可用性、移动相界和降低凝聚物形成的自由能来溶解 PGL-3/RNA 凝聚物，为理解细胞如何调控凝聚物稳定性提供了定量依据，助力探究相分离在发育和疾病中的作用。

　　

研究背景

细胞利用生物分子凝聚物（biomolecular condensates）来组织生化反应，这些凝聚物无膜结构，其形成和溶解机制却尚不明确。在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）早期胚胎中，P 颗粒是一种无膜细胞器，富含于生殖系。P 颗粒由众多蛋白质和 RNA 组成，包含 RGG 富集蛋白（如 PGLs）、RNA 解旋酶（如 GLHs）和内在无序蛋白（如 MEG-3/4）等。在卵母细胞中，P 颗粒对称分布于细胞质和核孔上；受精后，随着胚胎极化，细胞质中的 P 颗粒会聚集到单细胞胚胎的一端。研究表明，P 颗粒的这种聚集对于未来生殖系的形成至关重要，且受到胚胎极性机制的调控。

在单细胞阶段，胚胎皮层会分成两个区域，形成细胞质 MEX-5 梯度。已有研究显示，这种 MEX-5 梯度是 P 颗粒聚集所必需的。由于 MEX-5 梯度与 P 颗粒聚集梯度相反，有观点认为，MEX-5 通过抑制前端 P 颗粒的凝聚，使后端能够通过相分离形成 P 颗粒，进而实现 P 颗粒的聚集。MEX-5 对 RNA 具有高亲和力但低特异性，推测它可能通过与 P 颗粒蛋白竞争 RNA 结合位点，抑制前端 P 颗粒的形成。然而，MEX-5 干扰 P 颗粒并导致其溶解的具体机制仍不清楚。

研究方法

1. 体内 RNA 降解实验：通过向线虫性腺显微注射 RNaseA（一种可切割单链 RNA 的核酸内切酶）来降解 RNA，观察 P 颗粒相关蛋白 PGL-1 和 PGL-3 的凝聚物变化。同时设置对照组，注射与 RNaseOUT（RNase 抑制剂）混合的 RNaseA。
2. 体外 PGL-3 凝聚物重组实验：研究不同 RNA 序列（poly-rC、poly-rG、poly-rA 和 poly-rU）和浓度对 PGL-3 凝聚物形成及生物物理性质的影响。利用荧光恢复光漂白技术（FRAP）分析 PGL-3 在凝聚物中的扩散系数，通过定量相成像（Quantitative Phase Imaging）测量凝聚物的总聚合物浓度和折射率差。
3. MEX-5 相关实验：纯化功能性全长 MEX-5（MEX-5）及其锌指缺失变体（MEX-5ΔZF），通过滤膜结合实验测量 MEX-5 与 RNA 的结合亲和力。观察 MEX-5 和 MEX-5ΔZF 对预组装的 PGL-3/poly-rU 凝聚物体积的影响，探究 MEX-5 在凝聚物分解中的作用。
4. 微流体实验：运用组合液滴微流体平台，制备大量含有不同浓度溶质的水包油液滴，通过卷积神经网络对液滴进行成像和相分离分类，构建相图，研究 MEX-5 对 PGL-3/poly-rU 相分离边界的影响。同时，量化 PGL-3 稀相浓度，分析 MEX-5 对相分离热力学参数的影响。

研究结果

1. RNA 对 P 颗粒组装的影响：体内实验表明，降解 RNA 会导致线虫性腺中核周 PGL-1 和 PGL-3 凝聚物消失，说明 RNA 是 P 颗粒完整性所必需的。体外实验发现，RNA 序列和浓度对 PGL-3 凝聚物的形成和性质有显著影响。例如，PGL-3 在 poly-rC 存在下无法形成凝聚物，与 poly-rG 形成的凝聚物在高浓度时非球形，而与 poly-rA 和 poly-rU 形成的凝聚物在较宽浓度范围内呈球形。此外，随着 RNA 浓度增加，PGL-3 在凝聚物中的富集率先增后减，凝聚物的体积分数和总聚合物浓度也呈现非单调变化。
2. MEX-5 对 PGL-3/poly-rU 凝聚物的作用：MEX-5 通过其锌指结构域与 poly-rU 结合，是体外 PGL-3/poly-rU 凝聚物分解的必要条件。全长 MEX-5 与 (GUU)₁₀A₁₀ RNA 的结合亲和力比之前报道的 MEX-5 锌指片段高 50 倍。添加 MEX-5 可使预组装的 PGL-3/RNA 凝聚物体积在 1 小时内显著减小，且呈浓度依赖性；而 MEX-5ΔZF 则对凝聚物体积无明显影响。
3. MEX-5 对相分离边界的影响：微流体实验结果显示，增加 MEX-5 浓度会使 PGL-3 和 poly-rU 诱导凝聚物形成所需的浓度升高，即 MEX-5 使相分离边界向更高浓度方向移动。在低 RNA 浓度下，MEX-5 对相边界的影响最为显著，随着 RNA 浓度增加，这种影响逐渐减弱，当 RNA 浓度高于 20 ng/μL 时趋于平稳。锌指缺失突变体 MEX-5?ZF 对 PGL-3/poly-rU 相边界的影响极小，证实了 MEX-5 诱导的相边界移动与其 RNA 结合活性相关。
4. MEX-5 的作用机制：通过量化 PGL-3 稀相浓度，发现随着 MEX-5 浓度增加，PGL-3 在凝聚物中的占比降低，即 MEX-5 降低了 PGL-3 对相分离自由能变化的相对贡献。微流体扩散尺寸测量表明，MEX-5 对 poly-rU 的结合亲和力比 PGL-3 高 7 倍。综合这些结果，推测 MEX-5 通过与 PGL-3 竞争 RNA 结合位点，干扰 PGL-3/RNA 相互作用，减少 PGL-3 对凝聚物形成的自由能贡献，最终导致 PGL-3/RNA 凝聚物溶解。

研究讨论

本研究成功构建了体外实验体系，揭示了 MEX-5 溶解 PGL-3/RNA 凝聚物的机制。但该研究仍存在一定局限性。首先，实验中使用的标记蛋白可能会影响凝聚物的行为，尽管在体内实验中标记蛋白功能正常，但仍不能完全排除标记对其活性的影响。其次，实验体系为三溶质系统，与胚胎内的实际情况存在差异。在胚胎中，MEX-5 是两种激酶 MBK-2 和 PLK-1 的底物，这些激酶在卵母细胞向胚胎转变过程中被激活，对 P 颗粒的时空调节起着重要作用，但本研究未在体外探究激酶对 MEX-5 活性的影响。此外，研究中使用的是均聚物 RNA，而体内 RNA 结构更为复杂，RNA 解旋酶如 GLHs 可解开 RNA 二级结构，其在 P 颗粒分解中的作用尚未明确。未来研究可进一步探究这些因素对 MEX-5 依赖的 PGL-3/RNA 溶解的影响。