揭秘哺乳动物肾脏闰细胞多样性调控密码：Dmrt2 和 Hmx2 的关键作用

本文聚焦哺乳动物肾脏闰细胞（ICs），通过体内敲除和体外过表达实验，发现转录调节因子 Dmrt2 和 Hmx2/Hmx3 通过相互抑制机制决定 ICs 亚型命运，这一成果为深入理解肾脏发育及相关疾病机制提供关键线索，也为工程化构建功能性肾脏替代物奠定理论基础。

　　

引言

在成年哺乳动物肾脏中，主细胞（PCs）和闰细胞（ICs）协同维持水、盐和 pH 平衡。ICs 存在 A-IC、B-IC 和非 A 非 B 型 IC（nA/nB-IC）三种亚型，它们起源于不同细胞谱系，在肾脏中占据不同位置，且具有独特的基因表达模式。ICs 功能异常会引发远端肾小管酸中毒（dRTA）等疾病，因此研究 ICs 的发育和调控机制至关重要。此前研究已揭示了一些参与 ICs 发育的转录因子，如 Tfcp2l1、Foxp1 和 Foxi1 等，但对于 ICs 亚型特异性的调控机制仍有待深入探索。

研究结果

1. 早期 DMRT2 和 HMX2 表达区分哺乳动物 IC 亚型：通过对成年小鼠和人类肾脏的单细胞转录组分析发现，Dmrt2 在成熟 A-IC 中特异性表达，而 Hmx2/Hmx3 在 B-IC 和 nA/nB-IC 中表达。在小鼠出生后 0 天（P0）肾脏及 18 周人类胎儿肾脏样本的分析中，也观察到 Dmrt2⁺/Slc4a1⁺和 Hmx2⁺/Slc26a4⁺的互斥表达模式，分别指示早期 A-IC 和 B-IC 的发育。Monocle 分析显示，Dmrt2、Hmx2 和 Hmx3 在 IC 决定因子激活后、转运蛋白基因表达前开始表达，RNAscope 原位杂交进一步证实了它们在胚胎 18.5 天（e18.5）小鼠肾脏中的互斥表达，这表明这些基因在 IC 亚型分化早期发挥关键作用。
2. IC 亚型特化的遗传分析：利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建 Dmrt2 和 Hmx2/Hmx3 基因敲除小鼠模型。Dmrt2 敲除（KO）小鼠出生后因骨骼缺陷死亡，Hmx2/Hmx3 KO 小鼠在 P2 死亡。对 e18.5 肾脏进行分析，Dmrt2 KO 肾脏中，A-IC 富集基因如 Slc4a1 等下调，B - 和 / 或 nA/nB-IC 富集基因如 Hmx2、Slc26a4 等上调，表明 Dmrt2 促进 A-IC 命运，抑制 B - 和 / 或 nA/nB-IC 命运。Hmx2/Hmx3 KO 肾脏中，Slc26a4 等 B - 和 / 或 nA/nB-IC 相关基因下调，Dmrt2 和部分 A-IC 相关基因上调，说明 Hmx2/Hmx3 促进 B - 和 / 或 nA/nB-IC 命运，抑制 A-IC 命运。Dmrt2/Hmx2/Hmx3 三重突变肾脏中，出现同时表达 Slc4a1 和 Slc26a4 的混合 ICs，且这些细胞起源于 NPC 谱系，这揭示了 IC 调控程序中存在谱系差异。
3. Dmrt2 和 Hmx2 在 UPC 衍生类器官培养中的异位表达：在小鼠集合管类器官培养系统中，对 e11.5 输尿管芽（UB）进行研究。与野生型相比，Hmx2/Hmx3 突变体中 Hmx2、Hmx3 和 Slc26a4 表达下降，Dmrt2 和 Slc4a1 表达上升。通过感染携带不同基因的慢病毒，在类器官中异位表达转录调节因子。结果显示，过表达 Foxi1 可上调 Dmrt2；共表达 Foxi1 和 Dmrt2 促进 Slc4a1 表达，抑制 Hmx2 和 Slc26a4 表达；共表达 Foxi1 和 Hmx2 则下调 Dmrt2 和 Slc4a1 表达，上调 Slc26a4 表达，这进一步验证了 Dmrt2 和 Hmx2 在决定 IC 亚型命运中的相反作用。

讨论

本研究揭示了 Dmrt2 和 Hmx2/Hmx3 在 IC 亚型特异性决定中的关键作用。它们不仅通过相互抑制来抑制 IC 发育的替代途径，还分别对 A-IC 和 B-IC 基因活性具有正向促进作用。然而，这些因子如何同时作为抑制因子和激活因子发挥作用尚不清楚，且体内研究显示调控结果存在谱系和区域差异。例如，在三重突变 ICs 中，同时激活 Slc4a1 和 Slc26a4 的现象仅存在于皮质 NPC 衍生的细胞中；在肾脏髓质不同区域，ICs 对 Dmrt2 缺失的反应也不同。此外，成年肾脏中 ICs 存在一定的可塑性，如 PC 与 IC 的相互转化以及饮食诱导的 IC 亚型改变，这表明基因调控程序在维持 ICs 过程中具有灵活性。未来研究需要进一步确定 Dmrt2、Hmx2 和 Hmx3 作用的转录复合物和 DNA 靶标关联，以更深入地理解肾脏发育过程和成年肾脏的调控可塑性。

材料和方法

1. 动物护理和使用：动物实验经南加州大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查批准，严格遵循机构指南进行。通过杂合杂交繁殖动物，获取不同发育阶段的胚胎肾脏用于后续分析。
2. CRISPR sgRNA 设计：使用 Synthego ICE CRISPR 设计工具设计编辑靶点的 sgRNA，并从 Synthego 订购。
3. 电穿孔：按照先前描述的方法对受精卵进行基因编辑，去除透明带后，用预先形成的 CAS9/gRNA 复合物对胚胎进行电穿孔。
4. Sanger 测序和克隆分析验证 CRISPR 生成的品系：使用 GXL Taq 聚合酶扩增目标序列 PCR 产物，通过凝胶电泳、凝胶提取后进行 Sanger 测序。对于结果不明确的情况，进行 TOPO 克隆，挑选克隆进行测序和比对，以确定所需的等位基因。
5. 单细胞 RNA 测序分析：利用 Seurat v4 软件包分析已发表的 P0 小鼠肾脏、人类胎儿或儿科样本的单细胞测序数据，通过手动注释和亚聚类分析鉴定输尿管谱系细胞中的 IC 类型。
6. Monocle2 伪时间分析：运用 Monocle2 软件包对 P0 单细胞 RNA 测序数据进行伪时间分析，亚聚类收集管细胞类型，筛选输尿管谱系细胞进行处理，生成热图展示 IC 亚型分化关键基因的表达变化。
7. 鉴定小鼠转录因子：使用 OrthoRetriever 将人类转录因子列表转换为小鼠直系同源物，并与 P0 IC 簇的差异表达基因列表进行交叉参考，在点图上展示结果。
8. 组织制备：将肾脏样本在 4% 多聚甲醛中固定，经蔗糖处理后包埋，切成 12μm 切片用于组织学分析。
9. 免疫荧光：按照先前方法进行免疫荧光染色，使用 0.1% Triton-X100/PBS 或 0.1% Tween-20/TBS 作为通透剂。
10. RNAscope 检测转录本：根据制造商协议对固定冷冻组织进行 RNAscope Multiplex Fluorescent v2 检测，并进行适当修改。
11. 免疫荧光切片成像：使用 Leica Sp8 DLSM 共聚焦显微镜在 40× 下对免疫荧光和 RNAscope 切片进行成像，确保对肾脏切片和类器官切片的有效覆盖。
12. RNAscope 图像定量：利用 QuPath 软件对 RNAscope 检测后的切片进行细胞定量分析，计算 Foxi1⁺与各亚型特异性标记物共阳性细胞的比例。
13. 批量 RNA 测序分析：提取 e18.5 小鼠肾脏 RNA，进行文库制备和测序，使用 DESeq2 进行差异表达分析，确定基因表达变化的统计学意义。
14. 慢病毒生成：通过 Gibson Assembly 构建慢病毒转导载体，将相关载体转染到 HEK293T 细胞中，收获上清液并浓缩病毒，进行滴度测定。
15. 慢病毒感染成纤维细胞：将人类成纤维细胞感染慢病毒，使用多聚溴化乙锭（polybrene）辅助感染，感染后进行免疫荧光检测。
16. 类器官培养：分离 E11.5 小鼠 UB，在体外培养、感染病毒后，在特定培养基中培养并添加多西环素（dox）诱导基因表达，收获类器官进行分析。
17. 类器官组织学分析制备：固定类器官，经蔗糖处理后包埋，切成 7μm 切片用于组织学分析。
18. 组织储存和单核分离：对人类胎儿肾脏进行精细处理，使用特定缓冲液裂解细胞，通过多次过滤和离心获得单核悬液。
19. 多组学测序和分析：使用 10X Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome 试剂进行单核 RNA 测序和 ATAC 测序文库构建，测序后进行数据分析。