抗原移动性：调控 B 细胞免疫突触中抗原捕获动态与精准度的关键因素

本文聚焦 B 细胞免疫突触中抗原捕获机制。研究发现，抗原移动性（antigen mobility）影响 B 细胞对其捕获的速度、选择性，还能重塑突触结构。这一成果揭示抗原呈递细胞（APC）可借此调控 B 细胞活化，为理解免疫反应及抗体生成提供新思路。

　　

抗原移动性在 B 细胞免疫突触中的关键作用

在免疫系统中，B 细胞对病原体的防御机制至关重要，其核心环节是通过免疫突触从抗原呈递细胞（APC）表面捕获和识别抗原，这一过程直接关系到抗体的产生和免疫反应的有效性。长期以来，B 细胞受体（BCR）与抗原的结合亲和力被视为驱动这一过程的主要因素。然而，越来越多的研究表明，抗原在呈递膜内的移动性这一外在因素，对 B 细胞的抗原捕获和免疫反应有着深远影响。

研究背景

为了产生具有保护作用的抗体，B 细胞必须精准地捕获并识别展示在 APC 细胞膜上的抗原。当 B 细胞通过 BCR 与抗原结合后，会将抗原内化并加工处理，最终把抗原肽呈现在主要组织相容性复合体 II 类（MHCII）分子上。这一呈递过程会引发 T 细胞的辅助作用，结合 BCR 诱导的代谢和转录激活，驱动 B 细胞的增殖、分化，使其转变为浆细胞、记忆细胞或生发中心细胞。在这个过程中，通过类别转换重组和体细胞突变，活化的 B 细胞能够产生多样化的 BCR，从而建立起一个可以产生广泛且高效抗体的细胞库，并维持免疫记忆。但如果没有 T 细胞的帮助，受到抗原刺激的 B 细胞就会走向凋亡。所以，B 细胞内化和呈递抗原的能力对其命运起着决定性作用。

在次级淋巴器官中，APC 会在表面展示完整的多价抗原，供 B 细胞进行扫描识别。B 细胞利用基于肌动蛋白的膜突起，快速用 BCR 探测 APC 表面。当没有同源抗原时，这个探测过程通常只持续约五分钟；而一旦遇到同源抗原，B 细胞就会形成一个更持久的免疫突触。在免疫突触形成初期，B 细胞会通过肌动蛋白驱动在 APC 表面铺展，以最大化抗原结合面积；随后，肌动蛋白和微管网络协同作用，将抗原从突触周边向中心清扫。在这个向心运动过程中，肌动球蛋白结构会对 BCR - 抗原键施加拉力，断裂低亲和力的相互作用，同时提取高亲和力的抗原进行内化。这一过程选择性地促进了高亲和力 B 细胞的存活，最终推动高亲和力抗体的产生。

B 细胞不仅利用机械力提取膜上的抗原，还能感知 APC 的物理特性。B 细胞与 APC 的相互作用是通过一系列非共价连接的蛋白质实现的，包括 BCR、抗原、连接分子（如抗体和补体）以及 APC 受体（如 Fc 和补体受体）。从 BCR 通过这些分子连接传递的力会形成一种 “拔河” 效应，使得抗原获取对每个结合界面的相对强度都非常敏感。例如，当 B 细胞牵拉牢固锚定在刚性 APC 膜上的抗原时，虽然可以实现精确的亲和力识别，但抗原提取效率较低；相反，弱连接的抗原或柔软的 APC 膜虽然能提高提取效率，却会牺牲亲和力识别的精度。因此，B 细胞抗原捕获的精确性不仅取决于 BCR - 抗原键的亲和力和机械抗性，还与 APC 的物理特性及其抗原锚定分子密切相关。

APC 膜的性质多样，其流动性受膜粘度以及膜分子与皮质细胞骨架之间相互作用的影响。在 B 细胞激活研究中，常使用允许连接抗原自由扩散的流体平面脂质双层（PLB），但实际 APC 上呈递抗原的受体在质膜内的移动性却受到很大限制。这种抗原移动性的差异会深刻影响 B 细胞激活的早期事件。高抗原移动性能够促进 BCR 微簇的生长、信号传导和运输，而低抗原移动性则有利于细胞铺展和产生牵引力。然而，抗原移动性对 B 细胞抗原内化的影响此前尚未得到深入研究。目前存在两种推测：一是高移动性抗原可能通过增强信号通路的激活，优先被内化，因为这些信号通路可以组装产生力的肌动球蛋白结构；二是低移动性抗原可能通过 BCR 与向心肌动蛋白流的摩擦耦合，加载更高的力，从而更有效地从其连接物上拽下抗原。此外，免疫突触中依赖于移动性的力变化可能会影响抗原提取的时空动态，以及内化抗原随后向加工区室的运输。

实验设计与方法

为了深入探究这些可能性，研究人员利用 DNA 纳米结构创建多价抗原，并对不同粘度模型膜上抗原在力介导下的提取过程进行量化分析。研究人员假设，增加膜粘度从而降低抗原移动性，会放大 BCR - 抗原键上的力，进而提高抗原摄取的效率和精度。

在实验中，研究人员将抗原偶联的 DNA 纳米结构与玻璃支持的 PLB 相结合，以此独立控制抗原的价态和移动性。DNA 纳米结构相较于蛋白质支架具有明显优势，它可以精确控制连接抗原的数量，而且还能在每个 DNA 结构上添加特定数量的荧光团，用于定量分析抗原密度。研究人员制备了与 NIP（4 - 羟基 - 3 - 碘 - 5 - 硝基苯基）偶联的 DNA 结构，NIP 是一种半抗原，能与初级未成熟 B1 - 8 B 细胞的 BCR 以 3D K_d值为 0.33 μM 的亲和力结合。每个 DNA 结构共价结合三个 NIP 分子，通过计算分析，这些 NIP 分子间的平均距离在平衡时小于 1nm，完全伸展时可达 2.9nm。由于 IgM 类 BCR 无法与间距小于 3.6nm 的抗原进行二价结合，所以每个三价抗原 - DNA 构建体可能会诱导 2 - 3 个 BCR 发生交联。

为了调控抗原的移动性，研究人员使用 DOPC 或 DPPC 脂质构建 PLB。这两种脂质具有相同的头部基团，能保持与细胞相互作用的化学组成恒定，但尾部基团不同，会改变脂质的堆积方式，从而导致 DOPC 膜的表面粘度为 8.4×10^–11 Pa?s?m，DPPC 膜的表面粘度为 3.0×10^–9 Pa?s?m。通过对掺杂荧光脂质的 PLB 进行荧光漂白恢复（FRAP）测量，证实了 DOPC 和 DPPC 双层膜的粘度差异。DOPC 双层膜在 28s 内恢复到 95%，符合低粘度膜中高移动性脂质的预期；而 DPPC 双层膜仅恢复约 2%，表明其高粘度限制了脂质的运动。研究人员还通过单粒子追踪技术测量了抗原 - DNA 结构在 PLB 上的扩散情况，结果显示，在 DOPC 膜上的扩散常数为 1.9±0.77 μm²/s，在 DPPC 膜上为 0.057±0.025 μm²/s，这表明 PLB 粘度增加 35 倍，抗原 - DNA 移动性降低了 33 倍，这一变化符合与斯托克斯 - 爱因斯坦类似的表达式。此外，从 MSD 与时间的对数对数图中确定的反常扩散指数也显示，DPPC 膜对 DNA 传感器的限制作用比 DOPC 膜更强。值得注意的是，DPPC 膜上抗原 - DNA 的扩散常数与亚囊下窦巨噬细胞表面免疫复合物的平均扩散常数（0.011 μm²/s）非常接近，这意味着通过改变双层膜粘度，能够可靠地模拟 B 细胞在体内遇到的抗原移动性特征。

实验结果

1. 高底物粘度对 B 细胞早期激活事件的影响：研究人员用 NIP₃ - DNA 包被的 PLB 刺激 B1 - 8 B 细胞，以探究双层膜粘度（即抗原移动性）对 B 细胞早期激活事件的影响。通过调整 NIP₃ - DNA 的密度，使其平均达到约 3,000 个 /μm²，这个密度接近 B 细胞在体内可能遇到的上限。利用全内反射荧光（TIRF）显微镜和定量图像分析，研究人员发现 B 细胞在 DPPC 膜上的铺展程度比在 DOPC 膜上更广泛，这表明 B 细胞在更高粘度的表面上会施加更高的牵引力。然而，尽管在 DPPC 膜上 B 细胞的铺展增加，但形成的 BCR - 抗原微簇更小，总体积累的抗原也比在 DOPC 膜上少。在 DOPC 膜上，B 细胞会在细胞 - 双层接触的中心聚集大量抗原；而在 DPPC 膜上，抗原则更均匀地分布在细胞 - 双层界面，聚集程度较低。尽管在 DPPC 膜上结合的抗原较少，但 B 细胞在 DPPC 膜上对 Syk 和肌球蛋白轻链的磷酸化，以及肌动蛋白的聚合程度，与在 DOPC 膜上相当。这表明三价抗原对 BCR 的交联可能足以诱导强大的信号传导，即使在免疫突触中没有全局 BCR 重塑的情况下也是如此，可能是因为局部抗原浓度达到了激活所需的临界阈值。此外，由于 BCR 是机械敏感受体，增加的表面粘度所促进的更高牵引力可能会放大 BCR 信号，以补偿抗原结合的减少。
2. 抗原移动性对钙通量和转录因子易位的影响：BCR 附近信号蛋白的募集和磷酸化会导致细胞内钙的动员，钙通过其幅度和振荡来编码信息，进而激活转录因子如核因子 κB（NF - κB）和活化 T 细胞核因子（NFAT），调节细胞的长期过程，包括生存、增殖和分化。研究人员通过加载荧光钙敏感染料 Cal - 520 AM，对 B 细胞进行实时成像，评估细胞内钙的动员情况。结果显示，B 细胞在 DOPC 膜上受到刺激时的细胞内钙通量略高于在 DPPC 膜上的情况，但差异并不显著，且钙通量的动力学相似。研究人员还分析了钙振荡模式，将每个细胞的钙通量分为振荡型、持续型、单次型和无反应型四类。结果发现，细胞在 DPPC 膜上更容易发生钙通量（93%），而在 DOPC 膜上为 80%，这与之前的假设一致，即更高粘度膜上的抗原能更有效地触发 BCR。在有反应的细胞中，不同条件下钙激活模式的分布相似，大多数细胞表现为单次钙峰。相应地，B 细胞在两种表面上刺激时，NF - κB 的 p65 亚基和 NFAT 向细胞核的易位程度相同。当将激活定义为核质荧光强度比大于 1 时，约 66% 的细胞激活了 NF - κB，82% 的细胞激活了 NFAT。这些结果表明，虽然抗原移动性会影响钙反应的初始可能性，但高移动性和低移动性抗原都能通过钙释放到 NF - κB 和 NFAT，引发强大的信号传播，导致相似的 BCR 触发信号表型。
3. B 细胞从高粘度底物中提取抗原的效率更高：虽然之前的结果表明底物粘度对三价抗原刺激下的 BCR 信号传导影响不大，但 B 细胞在免疫反应中的繁殖适应性主要取决于其在免疫突触中提取和内化的抗原量。因此，研究人员重点关注了 B 细胞激活的这一方面。研究人员使用一种含有可在约 10 pN 外力作用下解链的 DNA 双链传感器，该传感器在双链底部有 Atto647N 荧光团和 Iowa Black RQ 淬灭剂对。双链断裂后，Atto647N 会发出荧光，并与 NIP₃抗原一起被运输到内体区室。由于每个 NIP₃抗原都与一个 Atto647N 荧光团一起运输，所以 Atto647N 荧光强度可作为细胞捕获抗原总量的指标。为了量化免疫突触中结合的抗原总量，在双链断裂后留在底物上的底部 DNA 链用 Atto550 荧光团标记。结果显示，刺激 45 分钟后，B 细胞在 DPPC 膜上形成的免疫突触中积累的抗原比在 DOPC 膜上少，这与之前使用非内化 NIP₃抗原的结果一致。然而，尽管在 DPPC 膜上结合的抗原少得多，但 B 细胞内化的抗原量与在 DOPC 膜上的细胞相当，从提取的总抗原量、提取的抗原簇数量以及每个簇中的抗原量等指标都可以看出这一点。因此，B 细胞在 DPPC 膜上形成的免疫突触中内化的可用抗原分子比例更大，这表明高粘度底物能提高 B 细胞捕获抗原的效率。
4. 底物粘度影响免疫突触中抗原提取的时空动态：虽然测量 45 分钟后的抗原提取量可以揭示 B 细胞从呈递膜获取抗原的能力，但无法捕捉这一过程的动态变化。由于 B 细胞与 APC 的接触具有短暂性，研究人员试图确定抗原移动性的差异是否会影响抗原捕获的动力学。通过实时细胞显微镜检测 DNA 双链断裂导致的 Atto647N 荧光猝灭解除后出现的荧光斑点，并进行追踪，研究人员发现 B 细胞从 DPPC 膜内化抗原的速度明显快于 DOPC 膜，从 DPPC 膜内化第一个抗原簇的平均时间为 74 秒，而从 DOPC 膜则需要 421 秒。此外，64% 的 B 细胞在 5 分钟内从 DPPC 膜内化了至少一个抗原簇，而从 DOPC 膜内化的比例仅为 26%。这表明降低抗原移动性使 B 细胞能够在体内 B 细胞 - APC 相互作用的快速时间尺度上捕获抗原。

目前有一种假设认为，抗原在免疫突触中的集中化对于 B 细胞提取和内化抗原是必要的。为了验证这一假设，研究人员分析了单粒子轨迹中提取的抗原簇的空间坐标，使用抗 IgM Fab 表面标记来定义细胞边界，测量每个簇与细胞中心的距离。结果显示，DOPC 膜和 DPPC 膜上抗原提取的时空动态明显不同。在 DPPC 膜上，B 细胞最初在内化抗原时，抗原距离细胞中心的平均距离为 1.9 μm，到 17 分钟时增加到 3 μm；而在 DOPC 膜上，在 30 分钟内，内化抗原的平均距离始终保持在 1.7 μm。这表明抗原移动性会影响免疫突触中抗原提取的位置。

考虑到 B 细胞在 DOPC 膜和 DPPC 膜上的铺展情况不同，研究人员进一步将免疫突触划分为三个等宽的同心区域（中心区、周边区和远端区），并量化从每个区域提取的抗原簇的比例。结果发现，抗原提取主要集中在细胞边缘，DOPC 膜上超过 80% 的抗原簇，DPPC 膜上超过 90% 的抗原簇都来自周边区或远端区，只有 15% 的 DOPC 膜抗原簇和 7% 的 DPPC 膜抗原簇来自免疫突触中心。这表明抗原集中化并非 B 细胞从呈递膜捕获抗原的必要条件。

B 细胞在 DOPC 膜和 DPPC 膜上形成的免疫突触中对抗原的聚集程度不同，研究人员因此研究了提取的抗原簇大小是否会随时间变化，以反映免疫突触中抗原积累的差异。通过量化每个提取抗原簇在初始检测帧中的强度，并将强度与提取时间作图，发现 DOPC 膜和 DPPC 膜上都存在正相关关系，这表明免疫突触中的抗原聚集促进了更大抗原簇的提取，且这种效应在 DOPC 膜上更为明显，反映了在这种高移动性底物上抗原聚集的程度更高。
5. 内化抗原在不同底物粘度下均能一致运输至 MHCII + 区室：抗原被输送到 MHCII + 区室进行加工和呈递对于抗体反应至关重要。由于观察到 B 细胞从 DOPC 膜和 DPPC 膜捕获抗原的时空动力学存在差异，研究人员质疑抗原在细胞内的运输方式是否也会不同。为此，研究人员让 B 细胞与 NIP₃ - DNA 包被的双层膜相互作用 20 分钟，然后固定细胞并使用抗 MHCII 抗体进行细胞内染色。通过 Z 轴堆叠图像和量化分析发现，内化的抗原簇被运输到了 MHCII + 区室，这可以从每个内化抗原簇的抗 MHCII 染色强度以及与 MHCII 共定位的内化抗原簇的百分比得到证实。这表明尽管抗原内化的效率、动力学和位置存在差异，但 B 细胞能够将内化的抗原引导到正确的细胞内区室进行加工和呈递。
6. 高底物粘度增强 B 细胞对抗原亲和力的识别：研究人员之前的研究表明，底物刚度会影响力施加在 BCR - 抗原键上的大小，进而影响 B 细胞识别抗原亲和力的能力。为了确定抗原移动性是否也有类似的影响，研究人员比较了 B 细胞区分 NIP₃和 NP₃（4 - 羟基 - 3 - 硝基苯基）的能力，NP₃与 B1 - 8 Fab 的结合亲和力比 NIP₃低约 10 倍。45 分钟后，B 细胞在 DPPC 膜上能够区分 NIP₃和 NP₃，这可以从细胞铺展面积、抗原结合和 Syk 磷酸化等方面体现出来；而在 DOPC 膜上，