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本文聚焦哥伦比亚农村人群，研究芽囊原虫（Blastocystis）与肠道微生物群关系。通过对 88 个样本分析，发现其携带和定植强度影响肠道细菌和真核微生物组成。该研究为理解肠道生态及芽囊原虫作用提供新视角，对肠道健康研究意义重大。
引言
芽囊原虫（Blastocystis）是一种广泛存在于人和动物肠道内的原生生物。长期以来，它在人类健康中的角色备受争议，传统观点视其为病原体，但越来越多证据表明，它可能是共生生物，甚至对肠道健康有益。一些研究发现，芽囊原虫定植与更健康的生活方式、多样化的肠道微生物群有关。不过，多数关于芽囊原虫携带的研究集中在看似健康的个体，且多基于西方化人群数据。西方化人群在社会经济、人口统计学、饮食和生活方式等方面与非西方化人群，尤其是农村人群存在显著差异，这些差异会塑造不同的微生物群特征。
农村社区的肠道寄生虫感染较为普遍，这可能与当地有限的医疗资源、清洁水供应以及饮食结构有关。在这样的背景下，研究芽囊原虫与肠道微生物群的相互作用具有重要意义。然而，目前针对农村人群中芽囊原虫及其与微生物群相互作用的综合研究较少，且以往研究多聚焦特定亚组（如学龄儿童），主要利用 16S rRNA 测序分析细菌成分，忽视了真核微生物在肠道微生物相互作用中的关键作用。此外，考虑到寄生虫感染强度可能对微生物群结构和组成产生重要影响，本研究旨在探究哥伦比亚非西方化农村社区人群中，芽囊原虫定植、定植强度与肠道微生物群（包括细菌和真核生物群落）组成之间的关系，明确芽囊原虫定植是否与微生物多样性变化及影响宿主健康的关键分类群存在关联。
方法
- 伦理声明：研究获得了哥伦比亚考卡大学（Universidad del Cauca）生物伦理委员会批准（项目编号 5735）。所有参与者或其父母、监护人都签署了知情同意书。
- 研究人群：研究在哥伦比亚西南部波帕扬市（Popayán）的拉斯瓜卡斯村（Las Guacas）开展。该社区肠道寄生虫感染率高，卫生条件差，居民获取饮用水困难。研究采用非概率便利抽样法，从同意参与研究并提供粪便样本的健康儿童和护理人员中收集了 88 份粪便样本。
- 粪便样本采集：使用无菌手套采集粪便样本，放入无菌容器，在 2 - 8°C 冷藏运输。到达实验室后，将样本存放在 - 80°C 超低温冰箱中，后续使用 Norgen 粪便 DNA 提取试剂盒进行 DNA 提取，提取过程包含初始破碎步骤。
- 微生物组测序与分析
- 引物设计：针对 16S rDNA 基因，使用修改后的通用原核引物 341F/806R，扩增 V3 - V4 高变区。正向引物 5' 端添加 3 个核苷酸（ACTCCTAYGGGRBGCASCAG，341F3），反向引物 5' 端添加 5 个核苷酸（AGCGTGGACTACNNGGGTATCTAAT，806R5），以符合标准 PCR 程序的退火温度参数。选择 18S rDNA 基因作为目标基因，设计 3 组引物（G3F1/G3R1、G4F3/G4R3、G6F1/G6R1）扩增真核生物（寄生虫和真菌）。引物设计过程包括对 18S rDNA 序列进行比对、生成共识序列、基于序列相似性分组以及与人类 18S rDNA 序列比对，以确保优先扩增非人类 18S rDNA。
- 文库制备与测序：使用 16S 和 3 组 18S 引物对纯化的基因组 DNA 进行扩增。PCR 反应分两步进行，第一步 PCR（PCR1）扩增 rDNA，第二步 PCR（PCR2）为测序准备，在扩增产物两端添加适配子、索引和测序引物位点。对 PCR2 产物进行定量后，等摩尔混合构建文库，再通过 Agencourt AMPure XP 磁珠纯化去除杂质，最终将纯化后的文库稀释至 7.5pM DNA，使用 0.001N NaOH 溶液调整浓度，在 Illumina MiSeq 台式测序仪上进行 2x250nt 双端测序。
- 数据分析：利用半商业软件 BION 进行数据分析，该软件基于 k - mer 方法进行物种注释，可处理非重叠双端测序数据和自定义参考数据库。分析过程包括去复用、引物提取、抽样、序列和质量筛选、去重、聚类、嵌合体检测、参考数据相似性评估以及分类映射和格式化。原核生物序列比对 RDP 参考数据库（v11.04），真核生物序列比对 SILVA 参考数据库（v128），并应用内部改进的分类定义。分类学分析时，物种水平 k - mer 相似性截断值设为 85%（约 98% 序列相似性），属水平设为 60%（约 95% 序列相似性），低于 60% 相似性的序列排除分析。使用 R 语言的 Phyloseq 包进行微生物多样性分析，计算多样性和丰度指数并绘图。通过线性判别分析效应大小（LEfSe）和 DESeq2 分析确定差异丰度分类群，LEfSe 分析的对数 LDA 评分阈值为 4.0，最大 kw 值为 0.01；DESeq2 分析的 p 值截断值为 0.05，FC 值截断值为 1.0。
- 芽囊原虫阳性和阴性分类及强度水平：依据 Illumina 测序技术针对 18S rDNA 基因 G3、G4 和 G6 区域生成的数据，评估芽囊原虫定植状态（阳性或阴性）和定植强度。通过分析所有样本的读数分布，确定以 100 个读数为阈值区分芽囊原虫的有无，大于 100 个读数为阳性，小于等于 100 个读数为阴性。对于阳性样本，采用修改后的四分位数法将定植强度分为低、中、高三个等级，具体读数范围为：低（110 - 694 读数）、中（694 - 6118 读数）、高（大于 6118 读数）。为使数据更适合参数统计分析，对阳性读数进行自然对数转换。同时进行敏感性检查，测试不同截断值（如三分位数和不同百分位数阈值），结果显示微生物群组成总体趋势一致，验证了分类方法的稳健性。
- 统计分析：定量变量以中位数和四分位数间距表示，定性变量以频率和比例表示。使用平均序列深度对每个样本的读数进行标准化，以相对丰度和 α 多样性指标（观察丰富度、香农指数和费希尔指数）作为组间比较指标。通过非参数 Mann - Whitney - Wilcoxon 检验和 Kruskal Wallis 检验比较 α 多样性指数，计算 Bray - Curtis 分类距离评估微生物群落组成差异（β 多样性），使用 vegan 包中的 adonis 函数进行置换多变量方差分析（PERMANOVA）。所有统计分析均在 R 软件中进行，通过 Kolmogorov - Smirnov 检验评估连续变量的正态性假设，双侧检验，p 值小于 0.05 为具有统计学意义。
- 机器学习模型：运用随机森林分类器，基于微生物群组成预测芽囊原虫定植状态。分析前对样本进行筛选，去除 Blastocystidae 家族的操作分类单元（OTUs，实际为扩增子序列变体 ASVs，文中统一用 OTUs 表示），并根据相对丰度 0.01% 的阈值去除稀有 OTUs。训练包含 100 棵树的随机森林模型，通过平均减少基尼指数确定 20 个最重要的 OTUs。利用混淆矩阵、精确率、召回率、F1 评分、特异性和受试者工作特征曲线（ROC）及曲线下面积（AUC）评估模型性能，使用 ggplot2 包进行 OTUs 可视化。
结果
- 总体微生物群概况：在分析的 88 个样本中，39 个样本（44.3%）检测到芽囊原虫，49 个样本（55.7%）为阴性。肠道微生物群的主要门类包括厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、子囊菌门（Ascomycota）和变形虫门（Amoebozoa）。其中，细菌中最丰富的科为毛螺菌科（Lachnospiraceae）和瘤胃球菌科（Ruminococcaceae），真核生物中为酵母科（Saccharomycetaceae）和内阿米巴科（Entamoebidae）。
- 细菌微生物群组成
- α 和 β 多样性分析：α 多样性分析显示，芽囊原虫阳性组的观察丰富度有升高趋势，但两组肠道细菌群落总体组成差异不显著。不过，不同芽囊原虫定植强度组间的多样性指标存在显著差异，中等定植强度组的观察丰富度高于阴性组。β 多样性分析表明，芽囊原虫阳性和阴性个体的细菌微生物群存在显著差异（PERMANOVA：adonis2，p = 0.0001），阳性个体中如均匀拟杆菌（Bacteroides uniformis）、颤杆菌属（Oscillibacter）和普通拟杆菌（Prevotella copri）等分类群更为丰富，而阴性个体中直肠真杆菌（Eubacterium rectale）和卢氏布劳特氏菌（Blautia luti）更为普遍。
- 相对丰度和差异分类群分析：芽囊原虫阳性和阴性组的微生物群主要由毛螺菌科、瘤胃球菌科、梭菌科（Clostridiaceae）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）和拟杆菌科（Bacteroidaceae）组成，但阳性组中毛螺菌科相对丰度降低，瘤胃球菌科和拟杆菌科相对丰度增加。LEfSe 和 DESeq2 分析发现，阳性组中拟杆菌属（Bacteroides）、粪杆菌属（Faecalibacterium）和阿利斯泰尔菌属（Alistipes）等属的丰度较高，阴性组中布劳特氏菌属（Blautia）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、肠球菌属（Enterococcus）和克雷伯菌属（Klebsiella）等属更为突出。不同定植强度组也有各自相关的特定分类群，高强度与阿利斯泰尔菌属、毛螺菌属（Lachnospira）和隐秘杆菌属（Arcanobacterium）相关；中等强度与醋弧菌属（Acetivibrio）和嗜胨菌属（Peptoniphilus）相关；低强度与拟杆菌属、袋形菌属（Phascolarctobacterium）、副普雷沃氏菌属（Paraprevotella）和阿克曼菌属（Akkermansia）相关。
- 真核微生物群组成
- α 和 β 多样性分析：α 多样性指数在芽囊原虫阳性和阴性组间无显著差异，但根据定植强度分析发现，高强度组的真核生物多样性低于阴性组（Mann - Whitney - Wilcoxon 检验，p < 0.05）。β 多样性分析显示，阳性和阴性个体的真核微生物群组成存在显著差异（PERMANOVA：adonis2，p = 0.0001），阳性个体中常见大肠杆菌内阿米巴（Entamoeba coli），而阴性个体中酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和白色念珠菌（Candida albicans）更为典型。
- 相对丰度和差异分类群分析：真核微生物群中，两组主要由酵母科、芽囊原虫科（Blastocystidae）、内阿米巴科、马拉色菌科（Malasseziaceae）和毛霉科（Trichomycetes）组成。阳性组中酵母科相对丰度降低，内阿米巴科相对丰度增加。随着芽囊原虫定植强度升高，其他真核生物，尤其是酵母科和马拉色菌科的真菌相对丰度降低，而内阿米巴科在所有强度组的阳性个体中相对丰度均较高。LEfSe 和 DESeq2 分析表明，阳性组中 Barnettozyma 属、内阿米巴属（Entamoeba）和内蜒属（Endolimax）等属的丰度存在差异，阴性组中念珠菌属（Candida）和马拉色菌属（Malassezia）更为丰富。不同定植强度组也有各自相关的特定真核分类群，高强度与 Issatchenkia 属、侧口虫属（Pleurostomophora）和 Citeromyces 属相关；低强度与 Adelina 属和 Cyniclomyces 属相关。
- 微生物群组成预测芽囊原虫存在：随机森林分类器基于微生物群组成预测芽囊原虫定植状态，袋外（OOB）错误率为 23.86%。在训练过程中，模型正确分类了 49 个阴性样本中的 41 个（分类错误率 = 16.3%）和 39 个阳性样本中的 26 个（分类错误率 = 33.3%）。在测试数据上，模型准确率达到 1.0，95% 置信区间为（0.9589，1），且准确率显著高于无信息率（p < 2.2e - 16）。模型确定的 20 个最重要的分类群中，如普拉梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）、卵形拟杆菌（Bacteroides ovatus）等，在区分芽囊原虫阳性和阴性定植中起重要作用，这些分类群多与肠道健康相关。
讨论
- 芽囊原虫与肠道微生物群及宿主健康的关系：本研究结果表明，芽囊原虫定植可能与肠道微生物群的组成和结构变化相关，这或许与之前在非西方化农村人群中观察到的宿主健康改善有关。已有研究显示，芽囊原虫与更健康的饮食（如植物性饮食）相关，且与改善的心脏代谢状况有关。本研究发现芽囊原虫的存在与细菌多样性增加有关，这表明它可能在促进微生物群落的多样性和稳定性方面发挥作用。微生物多样性的增加通常与更好的健康结果相关，因为多样化的微生物群能提供功能冗余，增强肠道对感染或饮食变化等干扰的抵抗力。
- 芽囊原虫对细菌微生物群的影响：β 多样性分析表明，芽囊原虫的存在会使细菌微生物群呈现出独特的特征，说明它可能调节肠道微生物群的结构和组成。在芽囊原虫阳性个体中，一些细菌分类群，如均匀拟杆菌、颤杆菌属和普通拟杆菌更为普遍。这些细菌在碳水化合物代谢、抗炎、维持肠道屏障完整性等方面发挥重要作用，有助于增强肠道的代谢和免疫功能，这对于高纤维饮食的非西方化农村人群尤为重要。此外，芽囊原虫定植强度似乎与特定微生物分类群相关，表明其对微生物群的影响可能存在剂量依赖性。高强度定植与具有抗炎特性的分类群（如阿利斯泰尔菌属和毛螺菌属）相关，低强度定植与阿克曼菌属相关，阿克曼菌属对维持肠道黏液层和改善代谢健康有益。这表明芽囊原虫与微生物群之间的相互作用较为复杂，可能受其在肠道中丰度的调节。
- 芽囊原虫对真核微生物群的影响：芽囊原虫定植与真核微生物群的特定特征有关。阳性组中大肠杆菌内阿米巴的丰度增加，而阴性组中酿酒酵母和白色念珠菌更为丰富。白色念珠菌虽为健康个体肠道微生物群的正常组成部分，但在某些情况下可能引发疾病，如黏膜疾病和血液感染，尤其在免疫功能低下的患者中。此外，芽囊原虫定植强度与特定真核分类群的丰度相关，高强度定植与 Issatchenkia 属、侧口虫属和 Citeromyces 属相关，这些属可能源于发酵食物和蔬菜的摄入，它们对肠道真核生物多样性的影响尚待进一步研究。
- 机器学习模型的应用及意义：随机森林分类器能够基于微生物群组成有效预测芽囊原虫定植状态，其性能优于随机猜测。模型确定的关键分类群，如普拉梭菌、卵形拟杆菌等，与肠道健康密切相关，这表明芽囊原虫定植可能与有益微生物群落的促进有关，这些微生物有助于维持肠道内环境稳定。该模型为预测芽囊原虫定植提供了有价值的工具，有助于深入理解微生物之间的相互作用，为未来开发针对肠道健康的干预措施提供参考。
- 研究局限性与展望：本研究存在一定局限性。样本量相对较小，且未收集详细的饮食信息。由于芽囊原虫与其他真核生物可能共同影响微生物群变化，未来需要开展纵向研究，结合宏基因组学、代谢组学和免疫学方法，同时收集饮食、生活方式和共病等综合数据，以更准确地推断芽囊原虫与宿主的相互作用
