编辑推荐：
本文聚焦巴基斯坦登革热（DENV）与登革热样疾病，研究其临床特征与血清型关联。通过对 349 例患者的研究发现，DENV 1 和 DENV 2 为主要血清型，且多数患者症状较轻。同时揭示了分子诊断的重要性，对防控登革热有重要意义。
1. 引言
登革热是由伊蚊传播的疾病，在热带和亚热带地区流行。它由 4 种不同血清型的登革病毒（DENV 1 - 4）引起，单一感染可提供对同型病毒的相对保护，再次感染其他血清型可能导致更严重的疾病。巴基斯坦自 1994 年起成为登革热流行国家，2022 年因暴雨和洪水，登革热病例大幅增加。
本研究在卡拉奇的阿迦汗大学医院进行，该地区卫生条件差，基础设施薄弱，利于蚊虫滋生。研究旨在回顾 2021 - 2023 年确诊和疑似登革热病例，分析不同登革热血清型的临床特征、流行情况，以及 PCR 检测相较于临床诊断的敏感性。
2. 方法论
2.1 伦理声明：研究获得阿迦汗大学伦理审查委员会（ERC）批准（批准号 ERC#4794），并获得所有参与者或其法定授权代表的书面知情同意，儿童则获得父母适当的同意或认可。
2.2 参与者招募：研究设计纳入具有急性发热性疾病临床症状（提示虫媒病毒或其他新兴病毒感染）的患者队列。样本量由 2021 年 6 月至 2023 年数据收集过程中的可用数据决定，最终纳入 349 例样本，多数来自卡拉奇地区。患者需符合 WHO 和泛美卫生组织（PAHO）的登革热诊断标准，不符合标准、拒绝同意或年龄不符的患者被排除。
2.3 病例定义：根据登革病毒（DENV）的血清学和分子证据，将患者分为 DENV + 和 DENV - 。DENV + 指 NS1 + 或 IgM + 或 PCR + 的参与者，DENV - 指 NS1 - 或 IgM - 且 PCR - 的参与者。
2.4 临床诊断：349 例登革热患者根据 WHO 标准分为严重登革热（SD）和非严重登革热（NSD），NSD 进一步分为有警告体征的登革热（DWS）、无警告体征的登革热（DWOS）和其他诊断类别，1 例样本记录缺失无法分类。
2.5 样本采集：在疾病急性期从每位参与者采集血液样本，置于 EDTA 管中，30 分钟内送至实验室，使用雅培 Panbio 登革热早期快速检测试剂盒检测 NS1 抗原，样本随后储存于 4°C，血浆分离后储存于 - 80°C。
2.6 RNA 提取：使用 QIAamp 病毒 RNA 提取试剂盒从血浆样本中提取 RNA，按照制造商的方案进行操作，RNA 洗脱后储存于 - 80°C，通过基于 RNase P 探针的 qRT - PCR 检测确认提取试剂的完整性和 RNA 的成功回收。
2.7 qRT - PCR 扩增：使用 Platinum Superscript III Invitrogen 一步法 qRT - PCR 试剂盒对提取的 RNA 进行泛登革热和登革热血清型 PCR 检测。引物和探针购自 Biosearch Technologies，阳性对照来自 BEI 资源，工作浓度调整为 20 μM，加入 RNA 模板后在 CFX96 Bio - Rad 平台上进行 qRT - PCR 反应，根据荧光信号判断结果。
2.8 统计分析：使用描述性统计计算定量变量，根据需要将临床实验室值与相应性别正常参考范围进行比较。对 DENV PCR + 和 PCR - 样本进行 Wilcoxon 秩和检验和 Kruskal Wallis 检验，使用 SPSS 和 R 软件进行 ROC 分析，计算敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）和曲线下面积（AUC），以 P 值 < 0.05 为有统计学意义，所有分析使用 R 软件 v.4.2.2 进行。
3. 结果
3.1 登革热感染的人口统计学和临床特征：研究共筛查 422 例患者，349 例符合纳入标准。2022 年 9 - 10 月因暴雨和洪水，约一半病例（168 例）在此期间纳入。DENV 阳性患者平均年龄为 33 ± 14 岁，DENV 阴性患者为 31 ± 15 岁，男性患者占比 60%。DENV 阳性和阴性队列在呼吸频率、淋巴细胞、中性粒细胞、血小板计数、白细胞（WBC）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）和肌酐等指标上存在显著差异。
在 283 例进行 Pan - Dengue - PCR 检测的样本中，203 例（71%）通过 qRT - PCR 检测为 DENV+，其中 157 例进行了 4 种 DENV 血清型检测。发热是所有登革热感染类别中最常见的症状，严重登革热（SD）感染中腹痛、身体疼痛和腹泻的比例高于其他类别。
3.2 登革热感染分子诊断的敏感性：基于临床诊断计算 q - RT PCR 的敏感性为 87.25%，特异性为 68.35%，PPV 为 87.68%，NPV 为 67.50%，AUC 为 0.780。对于金标准阳性样本（NS1 + 或 IgM+），qRT - PCR 敏感性为 86.63%，特异性为 67.50%，AUC 为 0.773。41 例最初 NS1 和 IgM 均为阴性的样本，经 qRT - PCR 检测，46% 为阳性，且检测到 DENV1 和 / 或 DENV2 血清型。
3.3 登革病毒血清型特异性检测：在 203 例 qRT - PCR 阳性病例中，157 例进行血清型检测。DENV 1 和 DENV 2 是主要血清型，分别占 27% 和 36%，DENV 3 占 3%，未检测到 DENV 4，13% 为混合血清型，20% 为非型 able 样本。各血清型的平均 Ct 值无显著差异。
3.4 登革热感染的临床表型：登革热 PCR 阳性和阴性患者的生命体征除体温外基本相似，部分患者体温略有升高，且差异有统计学意义。DENV + 患者中 9% 呼吸异常，DENV - 患者中 6% 呼吸异常，所有患者血氧饱和度正常。
血液学参数显示，DENV + 患者血小板计数低、AST 和 ALT 水平升高。不同血清型在肌酐水平上存在显著差异，DENV 1 和 DENV 2 血清型在血小板计数和肌酐水平上也有差异。严重登革热（SD）患者的 AST 和 ALT 水平显著高于非严重登革热（NSD）患者，SD 患者肾功能障碍的发生率也更高。血小板减少症的严重程度与疾病天数和住院时间相关，中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）在 SD 患者中显著异常，且与血小板计数呈正相关。
3.5 登革热混合血清型的临床诊断：203 例 PCR 阳性病例中，157 例进行血清型检测，46 例因试剂限制未进一步检测。126 例单一血清型阳性病例中，30 例最初 NS1 阴性但后来 DENV PCR+ 。31 例非型 able 血清型病例中，多数诊断为登革热、发热或肠道热等。混合血清型感染共 21 例，以 DENV 1 | DENV 2 为主，多数为无警告体征的登革热，且多数患者为住院患者。
4. 讨论
巴基斯坦多次爆发登革热，2022 年疫情严重，病例数增多与洪水相关，气候变化和城市化也影响了登革热的流行。本研究中男性和 16 - 45 岁成年人更易感染，与他们的户外活动和暴露机会有关。
血清型分析表明，DENV 1 和 DENV 2 是主要血清型，与之前报道一致。不同血清型与疾病严重程度的关系在不同研究中有差异，本研究中 DENV 2 与血小板减少症相关，但未发现混合感染（DV1/DV2）与更高等级血小板减少症的关联。
登革热患者常见症状为发热、恶心、呕吐、身体疼痛和头痛，生命体征除体温外差异不大，血液学参数中血小板计数、ALT 和 AST 水平异常较为突出，且在严重病例中更明显。
研究存在局限性，如严重登革热病例样本量有限、部分样本未进行测序和血清学确认等。但研究强调了分子诊断在登革热防控中的重要性，对于 NS1 和 IgM 阴性病例，应高度怀疑登革热并进行分子检测，以避免漏诊，改善患者管理和临床决策。同时，公共卫生领域需加强分子诊断应用，制定有效的防控策略，应对登革热对公共卫生的挑战。
