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为解决细胞与细胞外基质（ECM）形态学相互作用机制不明的问题，研究人员开展用 3D 打印模拟异质 ECM，探索其对细胞行为调控的研究。结果发现细胞偏好厚 ECM，通过伪足感知曲率差异迁移。该研究为组织工程 ECM 设计提供指导。
在生命的微观世界里，细胞如同一个个精密的小工厂，它们的行为和功能受到周围环境的严格调控，而细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）就是这个环境中极为重要的组成部分。许多生物组织和器官中的 ECM 呈现出多样化的形态，它们如同细胞的 “脚手架” 和 “指挥棒”，在细胞的迁移、分化、黏附等行为中发挥着关键作用 。例如，肌腱中的胶原纤维引导细胞伸长，血管的基底膜调节细胞排列，神经组织的 ECM 指导轴突定向。然而，长期以来，ECM 的形态学特性如何与细胞建立相互作用，这一问题一直缺乏广泛共识和直观理解，就像一团迷雾笼罩在科研人员的心头。
在组织工程和再生医学领域，开发能够准确复制天然 ECM 的体外模型系统至关重要。过去，虽然有一些技术能再现 ECM 的特定特征，如微纳沟槽诱导细胞黏附和施加空间约束，纳米拓扑结构诱导细胞内肌动蛋白纤维形成，但这些技术存在诸多局限性。随机微 / 纳米图案可靠性和可重复性差，传统微 / 纳米图案制造技术局限于特定基底，难以实现临床转化。因此，迫切需要一种新的方法来深入研究细胞与 ECM 的相互作用，为组织工程和再生医学的发展提供更坚实的理论基础。
浙江大学医学院附属口腔医院等机构的研究人员挺身而出，勇敢地挑战这一难题。他们利用高分辨率三维（3D）打印技术，精心构建出模拟异质 ECM 的模型，深入探索不同的 ECM 形态如何调控细胞行为。这项具有开创性的研究成果发表在《Cell Biomaterials》杂志上，为该领域带来了新的曙光。
研究人员在开展研究时，采用了多种关键技术方法。首先是 3D 打印技术，他们使用熔融静电写入（MEW）技术，以 FDA 批准的生物相容性聚己内酯（PCL）为材料，精确控制打印参数，制备出具有不同形态的 ECM 支架。其次，通过细胞培养实验，将骨髓间充质干细胞（BMSCs）接种在这些支架上，利用活细胞成像系统实时监测细胞行为。此外，还运用了扫描电子显微镜（SEM）、免疫组织化学染色、RNA 测序等技术，对细胞和支架的形态、细胞的取向和基因表达等进行全面分析 。
下面来看看具体的研究结果：
- 细胞对较厚 ECM 形态的偏好：研究人员打印了不同厚度的正交取向工程化异质 ECM，将 BMSCs 接种后进行观察。结果发现，细胞在培养过程中逐渐向较厚的支架（直径 20μm）迁移并积累，在 3 小时左右达到峰值，这表明细胞对较厚的 ECM 形态具有明显的偏好。从细胞迁移轨迹也能清晰地看到，初始位于中心区域的细胞会主动向较厚的支架迁移。
- 细胞与偏好的 ECM 取向对齐：研究人员制备了不同纤维尺寸的均质 ECM 和异质 ECM，通过细胞接种和免疫荧光染色观察细胞行为。结果显示，在异质 ECM 中，细胞会在 3 小时内识别周围环境，向厚纤维迁移并积累，最终沿着厚纤维的方向排列；而在均质 ECM 中，细胞表现出各向同性排列，不过在均质厚支架中细胞会出现部分各向异性排列。此外，不同类型的哺乳动物细胞在异质 ECM 中均表现出对厚纤维的偏好，这说明这种偏好具有普遍性。
- 曲率而非黏附位点决定细胞在 ECM 中的选择性黏附：研究人员最初假设细胞在 PCL 网格支架上的黏附位点差异可能导致选择性迁移，于是对纤维表面进行修饰，增加或减少黏附位点。但实验结果表明，无论黏附位点如何改变，细胞仍然倾向于沿着厚支架方向排列，这说明黏附位点差异不是选择性迁移的原因。随后，研究人员通过热压重塑支架，改变其曲率，发现当支架曲率差异消除后，细胞表现出各向同性排列；而当支架具有不同的相对曲率（RC）时，细胞能够识别 RC 差异，向低 RC 的支架（较粗的支架）迁移并最终呈现各向同性排列。这充分证明了支架曲率差异才是驱动细胞选择性迁移的关键因素。
- 细胞对 ECM 中 RC 的敏感性：研究人员建立了有限元模拟模型，对细胞在不同曲率支架上的黏附和排列行为进行分析。结果发现，细胞在细纤维（5μm）上会发生显著的弯曲变形，产生较大的内部应力，而在粗纤维（20μm）上，只有当细胞短轴与纤维方向对齐时才会出现明显变形和应力。细胞倾向于将长轴与纤维延伸方向对齐，以最小化内部应力，维持正常形态。此外，研究人员还制备了不同 RC 的支架进行实验，结果表明，当支架的 RC 低于 1.6 时，细胞不再表现出明显的各向异性排列，这进一步证实了细胞对 RC 差异的敏感性。
- 细胞通过伪足感知 ECM 中的 RC 差异：细胞在异质环境中能够识别周围 ECM 的 RC，那么它们是如何做到的呢？研究人员发现，细胞在初始附着时会伸出片状伪足和丝状伪足。通过使用抑制剂抑制应力纤维、片状伪足和丝状伪足的形成，研究人员发现抑制丝状伪足形成后，细胞失去了检测支架曲率差异的能力，出现随机迁移和各向同性排列；而抑制片状伪足形成则会损害细胞的大规模运动能力，同样导致各向同性排列。这表明伪足相关的细胞结构对于细胞感知 ECM 中的 RC 差异至关重要，片状伪足与细胞迁移有关，丝状伪足与曲率感知有关。
- ECM 通过细胞内张力直接调节细胞形态：研究人员将 BMSCs 接种在 PCL 网格支架上培养，发现细胞在异质 ECM 中能够保持较高的活力（>90%）。在异质 ECM 中，细胞受到的内部应力是定向的，当应力积累超过临界阈值时，细胞形成的膜状微组织可能会破裂并向支架末端拉伸。这种应力通过细胞 - 细胞连接传递，导致细胞形态和空间排列发生变化，如细胞和细胞核的取向会与厚支架对齐，细胞的伸展面积、纵横比以及细胞核的纵横比等也会发生相应改变。这说明 ECM 可以通过调节细胞内机械应力来调控细胞形态。
- ECMs 间接调节细胞功能和命运：研究人员对不同 ECM 环境中的 BMSCs 进行 mRNA 测序，发现异质 ECM（X4Y1）中的细胞与均质 ECM 中的细胞相比，存在显著差异表达基因（DEGs）。异质 ECM 促进 BMSCs 向成骨分化，上调与机械刺激、成骨分化和细胞黏附相关的基因，如 YES1、YAP1、MYH3、ALPL、BMP2、RUNX2 等，同时下调与软骨细胞分化相关的基因，如 COMP、SOX9、ACAN 等。此外，异质 ECM 还能提高细胞的黏附能力，促进血管生成因子（VEGFA）和紧密连接蛋白（TJP1、OCLN）的表达，降低增殖相关因子（MKI67）的表达。随着培养时间的延长，异质 ECM 中细胞的基因表达差异更加明显，KEGG 富集分析表明机械刺激诱导的 ECM 形态变化可能通过激活肿瘤坏死因子（TNF）信号通路来引导细胞行为和决定细胞命运。碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红 S（ARS）染色结果也证实了异质 ECM 能促进细胞的成骨分化和矿化。
综上所述，这项研究揭示了细胞与 ECM 形态学相互作用的明确机制。细胞能够感知异质 ECM 中的 RC 差异，选择性地向低曲率区域迁移并排列，这种行为导致细胞形态和基因表达发生变化，最终影响细胞的功能和命运。该研究不仅为我们深入理解细胞行为提供了新的视角，还为组织工程中 ECM 的结构设计提供了宝贵的指导，有望推动再生医学的发展，为解决组织修复和器官再生等临床难题带来新的希望 。
