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在微生物代谢工程中，单基因或多基因修饰常导致代谢失衡，影响细菌生长和产物积累。研究人员针对此，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为对象，通过转录因子工程调控嘧啶和碳氮代谢，促进胞苷合成。结果显著提升胞苷产量，为优化微生物细胞工厂提供策略。
在医药领域，胞苷作为合成抗病毒和抗肿瘤药物的关键中间体，其生产备受关注。传统化学合成和核酸水解技术效率较低，微生物发酵法成为更具潜力的替代方案。然而，利用代谢工程对生产菌株进行单基因或多基因修饰时，常常会引发中央代谢失调，导致细菌生长与产物积累之间的平衡被打破，难以实现理想的产物产量。为了解决这一难题，宁夏大学的研究人员开展了一项重要研究，旨在通过转录因子工程调控枯草芽孢杆菌的嘧啶和碳氮代谢，进而促进胞苷的合成。该研究成果发表在《Microbial Cell Factories》杂志上。
研究人员采用了多种关键技术方法。在菌株构建方面，利用 CRISPR-Cas9 系统构建重组质粒，对相关基因进行敲除或突变。通过转录组测序（RNA-seq）和代谢组学分析，从基因表达和代谢物变化层面探究调控机制。同时，运用实时定量 PCR（RT-qPCR）验证基因转录水平的变化，并借助高效液相色谱（HPLC）测定胞苷含量 。
转录调节因子（PyrR 和 CcpA）敲除对胞苷生物合成的影响
研究人员构建了重组菌株 BSNX3（敲除pyrR）和 BSNX4（敲除ccpA） 。摇瓶发酵实验表明，BSNX3 的胞苷产量达到 0.67g/L，相较于起始菌株 BSNX2 显著提高，产量提升了 109.38% ，且pyr操纵子基因的转录水平显著上调。这表明敲除转录调节因子 PyrR 能够减弱对pyr操纵子的转录抑制，促使代谢通量向胞苷生物合成方向流动。而敲除 CcpA 的菌株 BSNX4，胞苷产量和细胞生长的 OD600值均下降，说明敲除 CcpA 影响了枯草芽孢杆菌对碳源的转运和利用，导致中央碳代谢失调，间接降低了胞苷合成途径的代谢通量。
全局转录因子 CcpA 的结构域分析与突变文库构建
研究人员对 CcpA 进行同源序列比对和结构域分析，发现其由 N 端 DNA 结合结构域（DBD）和 C 端二聚化效应结合结构域（DEBD）组成。基于此，构建了两个 CcpA 突变文库（D1 和 D2 结构域）。通过高通量筛选，获得了高胞苷产量的突变体，如 D1-M11（E43D）和 D2-M7（S77A/M103L/S281A/P314K）。将这五个突变整合后得到重组菌株 BSNX4-DM，其胞苷产量大幅提高，摇瓶发酵产量达到 2.03g/L 。
重组菌株 BSNX4-DM 的分批补料培养
为进一步探究重组菌株 BSNX4-DM 的生产性能，研究人员在 5L 生物反应器中进行分批补料培养。发酵过程中，细胞生长在前期占主导，OD600在 24h 达到峰值 41.34 。胞苷合成在 9h 后开始被检测到，48h 时胞苷产量达到 7.65g/L，是摇瓶发酵产量的 3.77 倍，胞苷产率和生产速率分别达到 0.06g/g 葡萄糖和 0.16g/L/h 。
PyrR 和 CcpA 修饰对胞苷生物合成影响的多组学分析
研究人员运用转录组学和代谢组学联合分析，探究 PyrR 和 CcpA 修饰对胞苷生物合成相关代谢途径的影响。转录组分析显示，敲除pyrR后，与核苷酸代谢、核糖体等相关的基因显著变化；CcpA 突变体中，碳代谢、氮代谢、核苷酸代谢和氨基酸代谢等多条途径的基因表达发生改变。代谢组分析表明，PyrR 敲除菌株中嘧啶代谢途径的代谢物显著上调，嘌呤代谢途径的代谢物下调；CcpA 突变菌株中，嘧啶代谢途径的代谢物增加，嘌呤代谢途径的代谢物减少，同时碳代谢、氨基酸代谢等相关代谢物也发生变化 。综合多组学分析结果，发现 PyrR 敲除增强了嘧啶代谢途径，促进胞苷合成；CcpA 突变重塑了中央碳氮代谢网络，使代谢流转向嘧啶核苷的从头合成途径，增加了胞苷合成前体的供应，从而促进胞苷积累 。
研究表明，敲除pyrR可有效促进胞苷合成，构建的 CcpA 突变体 BSNX4-DM 大幅提高了胞苷产量。多组学分析揭示了 PyrR 和 CcpA 修饰影响胞苷生物合成的分子机制。这些研究成果为优化微生物细胞工厂的碳氮代谢网络提供了重要依据，有助于构建更高效的胞苷生产菌株，推动微生物发酵生产胞苷在医药领域的应用。同时，研究也指出，胞苷的生物合成涉及复杂的调控网络，突变 CcpA 对枯草芽孢杆菌全局代谢流的调控机制仍需进一步深入研究 。
