编辑推荐：
肾脏厚壁升支（TAL）在水和离子稳态中至关重要。为探究 TAL 细胞异质性及 ROMK 分布，研究人员用 RNAscope 原位杂交、免疫荧光成像等技术，发现 TAL 存在细胞异质性，ROMK 分布与细胞类型相关，这为理解 TAL 功能提供新视角。
在人体的 “生命工厂”—— 肾脏中，有一个至关重要的 “离子调节车间”，那就是肾脏厚壁升支（TAL）。它对于维持人体的水和离子平衡起着关键作用，就像一个精准的天平，确保体内各种离子的含量恰到好处。TAL 通过一系列复杂的离子转运过程，调节血压、浓缩尿液，维持着身体内环境的稳定。然而，这个 “车间” 的运作机制并非完全清晰，长期以来，人们一直认为 TAL 在细胞和功能特性上相对均一，但随着研究的深入，越来越多的证据表明，事实并非如此。
以往研究发现，TAL 中存在一些特殊的细胞群体，如致密斑（MD）细胞，它们与周围细胞在形态和功能上存在差异。此外，单细胞 RNA 测序等技术也揭示出 TAL 存在多种不同的细胞类型。更为有趣的是，TAL 中肾髓质外钾通道（ROMK）的表达模式存在异质性，有些细胞的 ROMK 表达很强，而有些则几乎检测不到。但这种差异究竟是由于不同细胞类型导致的，还是仅仅是同一细胞类型内的生物学变异，一直是困扰科学家们的谜题。
为了解开这些谜团，来自瑞士苏黎世大学（University of Zurich）的研究人员 Christian Keller、Rui Ramos Santos 等人展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Pflügers Archiv - European Journal of Physiology》杂志上，为我们揭示了 TAL 细胞异质性以及 ROMK 分布的奥秘，对理解肾脏离子转运机制具有重要意义。
研究人员在此次研究中主要运用了以下几种关键技术方法：
- RNAscope 原位杂交（ISH）：该技术可以在组织切片上检测特定 mRNA 的表达位置和水平，帮助研究人员确定不同细胞中 ROMK 以及其他相关基因的转录情况。
- 迭代间接免疫荧光成像（4i multiplexing）：能够在同一组织切片上同时检测多种抗原，通过这种方法，研究人员可以更直观地观察到 ROMK 与其他蛋白在细胞中的共定位情况，以及不同细胞类型的蛋白表达特征。
- 机器学习与图像分析：利用 Ilastik 和 Fiji 等软件，对免疫荧光图像进行处理和分析，将图像转化为二进制图像，从而实现对 ROMK 阳性细胞面积、信号强度等指标的定量分析。
研究结果
- ROMK 在小鼠 TAL 中的异质性定位：通过对 NKCC2（一种 TAL 的标志性蛋白）和 ROMK 的双重免疫染色，研究人员发现，TAL 细胞中 ROMK 的顶端定位存在差异。部分细胞有很强的顶端 ROMK 表达，而另一些则完全没有。进一步的 RNAscope 检测显示，所有 TAL 细胞都表达编码 ROMK 的 Kcnj1 mRNA，这表明 ROMK 在所有 TAL 细胞中都有转录，但只有部分细胞将其转运到顶端膜上12。
- Ptger3 和 Foxq1 mRNA 表达与顶端 ROMK 的相关性：基于之前单细胞 RNA 测序研究发现，Foxq1 和 Ptger3 在不同的皮质 TAL 细胞群体中相互排斥表达。研究人员利用 RNAscope 原位杂交结合 ROMK 免疫染色，发现肾皮质和髓质外条纹（OMOS）中，所有顶端有 ROMK 定位的 TAL 细胞都表达 C6 标记蛋白 Ptger3；而表达 Foxq1 的细胞则缺乏顶端 ROMK。在髓质内条纹（OMIS）中，虽然顶端 ROMK 定位仍然存在异质性，但所有 OMIS TAL 细胞都表达 Ptger3 mRNA34。
- 顶端 ROMK 定位与 Claudin 和 Kir4.1 表达的关系：运用 4i multiplex 技术对 ROMK、Kir4.1、ZO - 1、Claudin10b（Cldn10b）、Claudin - 16（Cldn16）和 Claudin - 19（Cldn19）进行免疫染色。结果显示，在皮质 TAL 中，所有 Cldn10b 阳性的 TAL 细胞都有顶端 ROMK 定位，而所有 Kir4.1 阳性的 TAL 细胞则缺乏顶端 ROMK。此外，形成的紧密连接（TJ）要么是 Cldn10b 阳性，要么是 Cldn16 和 Cldn19 阳性，且与顶端 ROMK 的定位密切相关。在 OMIS TAL 中，所有 ZO - 1 阳性的 TJ 都显示 Cldn10b 免疫染色，但与 ROMK 是否顶端定位无关56。
- ROMK 在致密斑（MD）中的定位：MD 是位于肾小球血管极的一群特殊 TAL 细胞。研究发现，所有 MD 细胞都有顶端 ROMK 表达，但免疫染色强度比周围皮质 TAL 细胞弱78。
- 顶端 TAL 和 MD 表面 ROMK 阳性比例的量化：通过开发自动化的图像分析流程，研究人员对不同 TAL 节段（OMIS TAL、OMOS TAL、皮质 TAL）和 MD 中顶端表达 ROMK 的细胞表面比例进行量化。结果显示，皮质 TAL、OMOS TAL 和 OMIS TAL 中分别有 54.97% ± 3.15%、54.49% ± 2.74% 和 56.1% ± 2.5% 的顶端细胞表面为 ROMK 阳性；而 MD 中这一比例高达 94.3% ± 1.54%。同时，MD 细胞中顶端 ROMK 的丰度明显低于其他有顶端 ROMK 染色的皮质 TAL 细胞910。
- 基因修饰小鼠模型和不同性别小鼠中顶端 ROMK 异质性的研究：研究人员分析了基因修饰小鼠模型（如 NaCI 共转运体缺失的小鼠）和不同性别小鼠的存档组织，发现顶端 ROMK 丰度在不同基因型、性别和遗传背景的小鼠中相当稳定1112。
研究结论与讨论
综合上述研究结果，研究人员得出结论：小鼠皮质和 OMOS TAL 由三种不同的细胞亚型组成，即 TAL - I 细胞（顶端有 ROMK 的细胞）、TAL - II 细胞（顶端无 ROMK 的细胞）和 MD 细胞。OMIS TAL 的细胞虽然都表达 Cldn10b 和 Ptger3，但顶端 ROMK 的异质性与皮质和 OMOS TAL 相似。这种细胞异质性很可能支持 TAL 在离子转运中发挥特殊作用，从而有助于维持其生理功能。
此次研究具有重要意义。首先，明确了 ROMK 在 TAL 中的细胞异质性表达与细胞类型密切相关，而非随机变异，为进一步理解 TAL 的离子转运机制提供了新的视角。其次，研究发现不同 TAL 细胞类型在离子转运中的可能分工，如 TAL - I 细胞可能主要负责产生驱动离子转运的电位梯度，而 TAL - II 细胞则更适合钾离子的重吸收，这对于深入研究肾脏生理功能具有重要价值。此外，研究还表明 ROMK 在 MD 细胞中的重要作用，可能影响钠氯感知和管球反馈，为相关肾脏疾病的研究提供了潜在的靶点。
然而，该研究也存在一些局限性。例如，未分析 TAL - I 和 TAL - II 细胞的比例是否会随年龄或物种变化；研究仅依赖组织学成像，缺乏对细胞异质性的功能研究，也未探究 TAL - I 和 TAL - II 细胞是否可以发生转分化以及相关的调节因素。未来的研究可以针对这些方面展开，进一步深入探索 TAL 细胞异质性的奥秘，为肾脏疾病的治疗和预防提供更坚实的理论基础。
