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在转录组研究中，传统 Illumina 短读长测序存在诸多局限。为突破这些困境，研究人员开展脓毒症患者血液纳米孔直接 RNA 测序研究。结果表明，该技术与 Illumina 测序基因计数高度相关，还能揭示更多转录后生物标志物，为疾病研究提供新视角。
在生命科学和医学领域，转录组学研究对于了解疾病状态、开发针对性防治策略意义重大。传统的高通量短读长测序技术，如 Illumina 测序，虽然能提供高精度的序列数据和高覆盖率，但在转录本分析方面存在不少问题。它需要将 RNA 转化为互补 DNA（cDNA）并进行扩增，这一过程容易引入偏差，干扰转录本的准确量化。而且，短读长测序在转录本 / 基因长度、鸟嘌呤 - 胞嘧啶（GC）含量等方面存在表达偏差，还难以准确分辨转录本异构体，限制了对可变剪接模式和差异异构体表达的研究。同时，传统方法也很难探究共转录或转录后修饰（如 Poly (A) 尾长度变化）作为潜在生物标志物的价值。
为了攻克这些难题，来自澳大利亚和瑞士等多个研究机构的科研人员进行了一项深入研究。他们的研究成果发表在《BMC Infectious Diseases》杂志上，为脓毒症转录组生物标志物的探索开辟了新方向。
研究人员主要采用了牛津纳米孔技术（ONT）的直接 RNA 测序和 Illumina cDNA 测序两种关键技术方法。样本来源于 907 例评估脓毒症的儿童患者，从中选取 12 例（6 例确诊细菌感染、6 例确诊病毒感染）RNA 保存丰富的样本进行研究。
在基因和转录本表达定量比较方面，研究人员对 12 例脓毒症患者血液样本同时进行纳米孔直接 RNA 测序和 Illumina 测序。通过使用不同的 RNA 测序量化工具进行分析，发现纳米孔和 Illumina RNA 测序之间存在高度相关性，尤其是在使用 NanoCount 分析纳米孔数据、Kallisto 分析 Illumina 数据时，基因水平的平均皮尔逊相关性高达 0.927，转录本异构体水平为 0.736 。不过，研究也发现纳米孔测序存在基因长度偏向较短基因的问题，且两种测序平台都受 GC 含量影响。
对于 Poly (A) 尾长度的研究，研究人员利用 ONT Dorado 碱基识别器的内置功能估计转录本 3' 端 Poly (A) 尾长度。结果显示，线粒体转录本的 Poly (A) 长度集中在约 45 nt，而核转录本分布更广泛，峰值约 80 nt。基因集富集分析（GSEA）表明，短 Poly (A) 尾的基因在能量产生和蛋白质合成相关功能中显著富集，长 Poly (A) 尾的基因则在信号转导等特定细胞过程功能中富集 。在感染、疾病相关、核糖体和氧化磷酸化途径的转录本中，Poly (A) 长度较短，而免疫相关途径的转录本 Poly (A) 长度较长。
纳米孔测序在新型转录本异构体检测上展现出独特优势。研究人员利用 IsoQuant 和 SQANTI3 软件，在数据集中检测到大量转录本，其中有 240 个非人工合成的新型转录本异构体。这些新型异构体长度范围广，跨越所有染色体，且多为多外显子结构。
在探究细菌和病毒感染之间的差异表达和聚腺苷酸化时，研究人员对 6 例细菌感染和 6 例病毒感染患者的纳米孔直接 RNA 测序数据进行分析，鉴定出 9 个显著差异表达基因（DEGs），其中 8 个在病毒感染患者中表达更高，1 个在细菌感染患者中表达更高，且这些基因与之前 Illumina cDNA 测序结果一致。通过差异聚腺苷酸化分析，发现 19 个差异聚腺苷酸化基因（DPGs），不过经 bootstrap 方法检验，只有 2 个基因（TPM4 和 PIP4K2A）被认为是稳健的 DPGs 。主成分分析（PCA）图显示，基于基因表达和平均 Poly (A) 尾长度，病毒和细菌样本没有明显分离。
在差异转录本使用研究中，研究人员利用 DRIMSeq 和 StageR 软件，发现病毒和细菌感染样本之间存在显著的差异转录本使用（DTU），涉及 SOD2、RPS21、CD36 和 RPL37 等基因。这些基因在蛋白质合成、抗病毒信号调节、炎症反应和吞噬作用等过程中发挥重要作用。
综合来看，这项研究表明，纳米孔直接 RNA 测序和 Illumina cDNA 测序在基因表达估计上具有很强的相关性，但纳米孔直接 RNA 测序能揭示 RNA 调控的关键方面，如 Poly (A) 尾长度变化和新型异构体的发现，这些是 Illumina cDNA 测序难以做到的。研究人员首次利用纳米孔直接 RNA 测序可视化了人类血液 mRNA 中基因本体（GO）术语 / 京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路特异性的 Poly (A) 长度分布，为理解基因表达及其调控机制提供了更深入的视角。不过，纳米孔直接 RNA 测序也存在一些不足，如通量较低、相关分析流程有待完善、样本输入要求较高等。未来，随着技术的不断改进和研究的深入，纳米孔直接 RNA 测序有望在疾病机制研究和生物标志物发现方面发挥更大的作用，为生命科学和健康医学领域带来更多突破。
