补肺益肾方缓解慢性阻塞性肺疾病气道上皮细胞衰老的机制探秘：激活 AMPK-Sirt1-FoxO3a 通路与促进自噬的关键作用

慢性阻塞性肺疾病（COPD）严重影响患者生活，现有治疗手段疗效有限。研究人员探究补肺益肾方（BYF）对 COPD 的作用机制，发现 BYF 可激活 AMPK-Sirt1-FoxO3a 通路和自噬，抑制气道上皮细胞衰老，为 COPD 治疗提供新思路。

　　在呼吸健康领域，慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease，COPD）如同一个难以攻克的顽疾，严重威胁着人们的健康。它是一种以持续呼吸症状和部分可逆性气流受限为特征的异质性呼吸道疾病，给社会和经济带来了沉重的负担。目前，针对 COPD 的主要治疗策略，如支气管扩张剂和抗炎药物，在应对其复杂的病理变化时，效果并不理想。而且，COPD 患者气道上皮细胞衰老现象明显，这在疾病的发生发展中起着关键作用，然而相关机制却尚未完全明确。因此，寻找新的治疗靶点和药物迫在眉睫。

在这样的背景下，河南中医药大学的研究人员挺身而出，开展了一项意义重大的研究。他们聚焦于传统中药补肺益肾方（Bufei Yishen formula，BYF），致力于探究其对 COPD 的治疗机制，尤其是在缓解气道上皮细胞衰老方面的作用。该研究成果发表在《Scientific Reports》上，为 COPD 的治疗带来了新的希望。

研究人员为了深入探究 BYF 的作用机制，运用了多种关键技术方法。首先，建立了 COPD 大鼠模型和细胞衰老模型，模拟疾病发生的体内外环境。然后，通过网络药理学和转录组学分析，筛选 BYF 潜在的作用靶点和相关信号通路。此外，还运用了免疫荧光技术（Immunofluorescence technique，IF）、免疫组化染色（Immunohistochemical staining，IHC）、酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、蛋白质免疫印迹法（Western blot assay，WB）、实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time QPCR analysis，PCR）等多种实验技术，从不同层面检测相关指标，深入分析 BYF 的作用机制。

研究结果如下：

• BYF 改善 COPD 大鼠肺功能和病理损伤：研究人员通过让大鼠暴露于香烟烟雾和细菌感染的环境中，成功建立了 COPD 大鼠模型。实验结果显示，COPD 大鼠的肺功能出现显著下降，如潮气量（Tidal volume，TV）、分钟通气量（Minute volume，MV）、呼气峰流量（Peak expiratory flow，PEF）和 50% 潮气量时的呼气流量（Expiratory flow at 50% tidal volume，EF50）均有所降低，同时肺部出现明显的病理变化，包括肺泡结构破坏、肺泡数量减少、肺泡直径增大和支气管壁增厚。而口服 BYF 后，这些不良变化得到了明显抑制，表明 BYF 能够改善 COPD 大鼠的肺功能，减轻肺部病理损伤。
• BYF 抑制 COPD 大鼠肺部细胞衰老：细胞衰老具有细胞周期停滞、潜在凋亡和出现衰老相关分泌表型（Senescence-Associated Secretory Phenotype，SASP）等特征，SASP 会分泌促炎细胞因子和蛋白酶，进一步加重组织衰老。研究发现，BYF 处理后，COPD 大鼠肺组织和血清中的促炎细胞因子（如 IL-6、IL-1β、TNF-α）、蛋白酶（如 MMP-2、MMP-9）水平显著降低，而抗氧化蛋白 SOD2 的表达增加。同时，BYF 还上调了紧密连接蛋白（如 E-Cadherin、Occludin、Zonula Occludens-1）和表面活性蛋白 A（Surfactant protein A，SP-A）的表达，增强了肺组织的屏障功能。此外，BYF 降低了细胞周期抑制蛋白 p21 和 DNA 损伤标记物（γH2AX 和 TUNEL）的水平，提高了细胞增殖标记物 Ki67 的表达，表明 BYF 能够有效缓解 COPD 大鼠肺部的细胞衰老。
• BYF 抑制香烟烟雾提取物（Cigarette Smoke Extract，CSE）诱导的支气管上皮细胞衰老：在 COPD 患者的肺组织中，衰老细胞数量明显增加，而支气管上皮细胞作为抵御外界刺激的第一道防线，其衰老在 COPD 发病过程中起着重要作用。研究人员将 16HBE 细胞暴露于 BYF 不同组分（BYF1 - 6）后，再用 10% CSE 和 100ng/mL 脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激 24 小时。结果发现，BYF - 4 和 BYF - 5 能显著抑制 p21 蛋白的表达，且二者组合（BYF4/5）在 12.5 - 400μg/mL 浓度范围内对细胞活力无明显影响。进一步研究表明，BYF4/5 可显著降低 p53、p21 的 mRNA 和蛋白水平，同时减少促炎细胞因子（如 IL-1α、IL-1β、TNF-α）、趋化因子（如 CXCR2、CXCL8、MCP-1）、蛋白酶（如 MMP-1、MMP-8、MMP-9）的 mRNA 表达，并抑制 β - 半乳糖苷酶的活性，表明 BYF4/5 能有效减少支气管上皮细胞的衰老。
• BYF 抗衰老机制的网络分析：研究人员利用 UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 技术，从 BYF4/5 中鉴定出 67 种化合物，并预测了 770 个潜在靶点。通过构建蛋白质 - 蛋白质相互作用（Protein - Protein Interaction，PPI）网络和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，发现 p53、FoxO、TNF、NF-κB、趋化因子、AMPK、Hippo 等信号通路，以及细胞衰老、细胞周期、自噬等过程可能参与了 BYF 的抗衰老作用。Sankey 图显示，橙皮苷（hesperidin）、山柰酚（bergenin）、贝母辛（peimisine）、贝母甲素（peimine A）、川陈皮素（nobiletin）等化合物与细胞衰老、FoxO、自噬等相关蛋白结合。
• BYF4/5 的活性成分抑制细胞衰老并激活 AMPK-Sirt1-FoxO₃a 介导的自噬：研究表明，BYF4/5 中的橙皮苷和川陈皮素能够显著抑制 16HBE 细胞中 p21、p53 的 mRNA 和蛋白表达，降低 IL-1α、IL-1β、MMP-9 的 mRNA 水平，同时抑制 β - 半乳糖苷酶的活性，且对细胞活力无明显影响。在分子机制方面，橙皮苷和川陈皮素可显著上调磷酸化 AMPK 蛋白、Sirt1 和 LC3B II 的表达，下调 FoxO₃a 磷酸化水平和 HDAC mRNA 表达。体内实验也证实，BYF 能显著降低大鼠肺组织中 FoxO₃a 的蛋白表达，增强 AMPK、SIRT1 和 LC3 的表达，表明 BYF 的活性成分可能通过激活 AMPK-Sirt1-FoxO₃a 通路和自噬来抑制细胞衰老。

综上所述，本研究表明 BYF 能够缓解 COPD 大鼠的肺功能下降、病理改变、炎症反应和蛋白酶失衡，这可能是通过减轻气道上皮细胞衰老实现的。化学分析、网络药理学和转录组学研究揭示，BYF 含有多种化合物，这些化合物可与多个靶点结合，调节 AMPK、Sirt1、FoxO 和自噬等相关通路。体内研究进一步证实，BYF4/5 中的橙皮苷和川陈皮素能通过激活 AMPK-Sirt1-FoxO₃a 通路，增强细胞自噬，抑制细胞衰老。该研究为 COPD 的治疗提供了新的理论依据和潜在治疗策略，有助于推动 COPD 治疗领域的发展，为广大 COPD 患者带来新的希望。