ATP作为病原相关分子模式激活E3泛素连接酶RNF213的机制及其在先天免疫中的调控作用

本研究揭示了巨噬细胞中ATP通过结合RNF213的AAA核心激活其E3泛素连接酶活性的新机制。研究人员结合化学生物学与结构生物学手段，发现RNF213通过感知细胞内ATP水平动态调控其抗菌功能，并解析了其与E2-泛素转移复合物的冷冻电镜结构，为理解先天免疫中能量代谢与病原防御的偶联提供了新范式。

　　

在病原体与宿主的永恒博弈中，细胞自主免疫系统进化出了精密的分子传感器。其中，E3泛素连接酶RNF213因其独特的"双功能"结构引人注目——它不仅是人类蛋白质组中最大的E3泛素连接酶（约600kDa），更罕见地融合了AAA⁺ ATP酶模块。既往研究发现RNF213能抑制细菌、病毒和寄生虫等多种病原体，但其广谱抗菌活性的调控机制始终成谜。更令人费解的是，这个庞然大物如何协调ATP酶活性与泛素化功能？这些谜题对理解细胞防御系统的运作原理至关重要。

由奥地利科学院分子病理研究所Tim Clausen团队、英国邓迪大学Satpal Virdee团队等合作开展的研究，通过多学科交叉方法揭示了ATP作为"危险信号"直接激活RNF213的分子机制。该成果发表于《Nature Communications》，首次证明细胞内ATP浓度变化可动态调控E3酶活性，为代谢-免疫交叉调控提供了范例。

研究团队运用了四项关键技术：1）开发活细胞内E3泛素连接酶活性谱分析技术，通过电穿孔递送生物素标记的活性探针（ABP）；2）结合冷冻电镜解析RNF213-E2-泛素转移中间体结构（分辨率3.5?）；3）建立ATP依赖的体外泛素化检测体系；4）采用交叉linking质谱鉴定催化关键半胱氨酸位点。

ATP结合而非水解激活E3功能
通过构建Walker motif突变体（K2387A/WA3、K2736A/WA4破坏ATP结合，E2449Q/WB3、E2806Q/WB4阻断水解），发现仅ATP结合缺陷会显著降低RNF213对自身和细菌脂多糖（LPS）的泛素化活性。非水解类似物ATPγS同样有效激活，证实激活依赖结合而非水解（图1b-f）。

活细胞动态监测技术突破
创新性开发毛细管电穿孔递送生物素-ABP探针技术，首次实现活细胞内E3酶活性实时监测。在293T-RNF213KO细胞中，抑制糖酵解（2-DG处理）降低ATP水平导致RNF213-ABP信号减弱，而补充ATPγS可逆转此效应（图3a-e）。

干扰素通过ATP代谢调控E3活性
在THP-1巨噬细胞中，I/II型干扰素（IFN）处理16小时使ATP水平提升1.5-2倍，伴随RNF213活性增强（图3f-i）。这种激活可被2-DG阻断，表明IFN通过代谢重编程而非单纯增加蛋白表达来调控RNF213。

冷冻电镜揭示独特E2结合界面
3.5?结构显示UBE2L3通过CTD结构域（Phe5093/Trp5097/Tyr5106）与RNF213结合，而催化核心RZ域（含Cys4462-His4483催化二元体）呈现动态特性（图4b-d）。突变CTD关键残基（W5097A/E5108R）完全 abolished泛素化活性（图4e-g）。

RZ域锌指结构决定催化特异性
交叉linking质谱锁定Cys4462为接受泛素转移的活性位点。AlphaFold2预测的RZ域模型显示其通过Cys4451/His4455/Cys4471/Cys4474螯合锌离子维持结构，而Cys4462位于暴露环状区域，便于亲核攻击（图5a-e）。

这项研究确立了RNF213作为新型ATP依赖的E3泛素连接酶，其意义在于：1）首次揭示ATP可作为细胞内病原相关分子模式（PAMP）直接调控E3活性；2）阐明AAA⁺ ATP酶与E3模块的变构偶联机制；3）开发的活细胞E3活性谱技术为靶向泛素系统的药物研发提供新工具。值得注意的是，同源蛋白ZNFX1也存在类似RZ结构域，暗示该调控机制可能在先天免疫中具有普适性。

研究还提出了"代谢检查点"模型：病原感染→干扰素分泌→糖酵解增强→ATP积累→激活RNF213→泛素化病原组分。这种将能量代谢与免疫防御直接耦合的机制，为理解宿主-病原博弈提供了全新视角，也为开发针对结核杆菌、沙门氏菌等胞内病原体的干预策略指明方向。