探秘细菌捕食 “利器”：可适应尖端的 Tad 菌毛如何介导接触杀伤

在细菌捕食研究中，Myxococcus xanthus 通过接触杀伤猎物的机制不明。研究人员聚焦其 Kil 系统及相关 T3SS展开研究，发现 Kil 菌毛聚合、尖端复合物功能及与 T3SS关联等，为理解细菌捕食和 Tad 菌毛功能提供关键线索。

　　在神秘的微生物世界里，细菌之间的生存竞争时刻都在上演。Myxococcus xanthus（黄色粘球菌）作为一种常见的土壤细菌，它有着独特的生存方式 —— 通过与猎物直接接触来杀死对方，获取生存资源 。然而，长期以来，科学家们对这一过程背后的详细机制却知之甚少。黄色粘球菌究竟是如何精准识别猎物、发起攻击并成功将其消灭的呢？这一系列问题就像层层迷雾，笼罩在科研人员的心头，亟待解决。为了揭开这些谜团，来自法国 Aix Marseille Univ 等机构的研究人员展开了深入研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员主要运用了基因编辑技术、显微镜观察技术以及结构预测技术（如 AlphaFold）等方法。利用基因编辑构建各类突变菌株，通过显微镜观察菌毛聚合、猎物接触反应等现象，借助结构预测技术分析菌毛及相关蛋白结构。

研究结果

1. Myxococcus 在猎物接触位点聚合 Flp 菌毛：研究人员最初认为 KilK 是 Kil 系统的主要菌毛蛋白，但 kilK 缺失突变体的捕食效率仅适度下降，这表明 Kil 系统的主要菌毛蛋白可能另有其人。经过进一步探索，研究人员发现了 mxan_5121 基因，其编码的 KilP 蛋白具备真正的 Fimbrial low - molecular - weight proteins（Flp）特征。敲除 kilP 基因后，菌株在捕食大肠杆菌时完全丧失能力，而将带有荧光标记的 KilP_96C在野生型菌株中表达，当该菌株接触大肠杆菌时，能观察到在接触位点形成荧光焦点，随后荧光菌毛向猎物延伸并回缩，且菌毛形成与运动暂停和猎物细胞裂解相关。这一系列实验证明，Myxococcus 能够在猎物接触位点聚合 KilP 菌毛，且菌毛聚合由与猎物的接触诱导产生。
2. KilP 菌毛聚合依赖于 Kil 系统：为探究 Kil 系统在 KilP 菌毛聚合中的作用，研究人员观察了 KilP 菌毛与 Kil 系统中细胞质蛋白 KilD 的共定位情况。结果发现，在与猎物接触时，mCherry - KilD 簇的形成先于 KilP_96C在同一位置的积累，这说明 KilP 菌毛的聚合以 Kil 依赖的方式发生。此外，在缺乏 KilF（预测的 Kil 菌毛聚合 / 解聚 ATP 酶）的突变体中，KilP 菌毛的形成和猎物细胞裂解均被完全抑制，而在非运动性的 ΔpilAΔaglQ 菌株中，仍能观察到 KilP 菌毛的聚合且与猎物细胞裂解相关。这些结果表明，Kil 系统驱动 KilP 主要菌毛的聚合，且菌毛组装与猎物细胞裂解密切相关。
3. Myxococcus 拥有四种可能构成菌毛尖端的次要菌毛复合物：确定 KilP 为主要菌毛蛋白后，研究人员对 Kil 系统中其他预测的菌毛样蛋白进行了研究。AlphaFold 预测显示，KilL₄、KilM₄和 KilN₄形成一个异源三聚体复合物（Tip4），且 Myxococcus 基因组中还存在另外三个与 Tip4 结构相似的预测次要菌毛复合物（Tip1、Tip2 和 Tip3）。这些复合物都呈矛头状，其末端由 KilN 的 C 末端结构域构成，可能在菌毛尖端发挥作用。
4. 不同的次要菌毛 “Tip” 复合物在捕食中起重要作用：研究人员通过系统删除不同的 tip 基因簇，评估它们对捕食的影响。结果发现，单个 tip 基因簇缺失突变体在固体培养基上没有明显的捕食缺陷，在液体培养基中只有部分缺陷，而同时缺失所有四个 Tip（ΔTip^{1 + 2 + 3 + 4} = Tip^?）的突变体则完全丧失了在固体和液体培养基中的捕食能力。进一步研究不同 Tip 组合缺失的突变体发现，它们在捕食效率上存在差异，且不同 Tip 在不同环境条件下的重要性不同。此外，研究还发现 Tip 的转录水平影响其在捕食中的选择，且每个 Tip 都能引发菌毛延伸和猎物裂解，但效率有所不同。这表明，虽然所有 Tip 都有助于杀死猎物，但它们在捕食中具有部分冗余功能，且效率因环境条件而异。
5. Tip1、Tip2 和 Tip3 的功能需要 “无针” T3SS*：研究人员发现 Kil 系统和 T3SS在猎物接触位点同步招募，暗示它们在捕食过程中存在功能关联。通过对 ΔT3SS菌株的研究发现，该菌株能够杀死猎物但无法裂解猎物，且 KilP 菌毛的聚合不受影响，这表明 Kil 系统的组装和杀伤功能不依赖于 T3SS*，但 T3SS的定位依赖于 Kil 系统的组装。进一步研究发现，Tip1、Tip2 和 Tip3 只有在 T3SS存在的情况下才能杀死和裂解猎物细胞，而 Tip4 在没有 T3SS的情况下仍能杀死猎物，但无法裂解。这说明 Tip4 与其他 Tips 一样，与 T3SS协同作用实现猎物裂解，同时还具有 T3SS * 独立的杀伤活性。
6. 前导肽酶 KilA 与 Tip2、Tip3 和 Tip4 复合物的成熟有关：之前的研究表明，敲除 kilA 前导肽酶对 Myxococcus 的捕食效率没有影响，这与前导肽酶在菌毛蛋白成熟中的关键作用相悖。研究人员推测 KilA 可能特异性地加工一部分 Tip 菌毛蛋白。通过在单 Tip 表达菌株中删除 kilA 基因并测试其捕食效率，发现 KilA 对 Tip2、Tip3 和 Tip4 的功能至关重要，但对 Tip1 没有影响。这表明 KilA 作为前导肽酶，参与了 Tip2、Tip3 和 Tip4 复合物的成熟过程。
7. Flp 次要菌毛蛋白 KilK 和 KilO 与 Tip 复合物功能相关：研究人员重新研究了 KilK 和 KilO 的功能，发现它们与 Tip 复合物功能相关。在单 Tip 表达菌株中，删除 kilK 基因会废除 Tip1、Tip2 和 Tip4 的功能，删除 kilO 基因则只影响 Tip3 的功能，而同时删除 kilK 和 kilO 基因会导致菌株完全丧失捕食能力，且 KilP_96C的聚合也被完全抑制。这表明 KilK 主要作为 Tip1、Tip2 和 Tip4 的 “适配器” 菌毛蛋白，而 KilO 仅与 Tip3 相关，它们对于 Tip 复合物在菌毛末端的定位和菌毛聚合至关重要。
8. Kil 菌毛的分子模型：研究人员利用 AlphaFold 构建了 Kil 菌毛与不同 Tip 结合的模型。模型显示，KilP 菌毛由 KilP 蛋白自组装形成左手性 3 起始螺旋，其 C 末端 α₂螺旋展开，带电残基覆盖菌毛表面，赋予菌毛静电特性。同时，模型还揭示了 KilP、KilK、KilO 和 Tips 之间的相互作用，进一步支持了 KilK 和 KilO 作为适配器菌毛蛋白的功能，但未解释它们与特定 Tip 特异性结合的结构和序列特征。
9. 对不同猎物物种的捕食具有不同的 Tip 需求：研究人员测试了单 Tip 表达菌株对不同猎物物种（如新月柄杆菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌）的捕食效率，发现不同 Tip 对不同猎物的捕食效率存在显著差异。例如，Tip4 对所有测试的猎物物种都有活性，而 Tip1 对不同猎物的捕食效率则有所不同。这表明 Tip 的多样性不仅对捕食单一猎物很重要，对于杀死不同的细菌物种也至关重要。
10. Tad 菌毛在其他细菌物种中与 Tip 同源物存在遗传关联：研究人员分析了 Kil 相关次要菌毛蛋白在不同细菌物种中的分布情况，发现 Kil 相关的 tip 基因主要存在于 Myxococcota 基因组中，尤其是 Myxococcales 目。通过结构同源性分析，在其他捕食性细菌和人类致病细菌中也发现了类似 Tip 的复合物，这表明 Tad 菌毛在其他细菌中的末端也可能由类似 Tip 的次要菌毛复合物进行功能定制。

研究结论与讨论

这项研究揭示了黄色粘球菌捕食过程中 Kil 系统的重要机制。Kil 菌毛在与猎物接触时聚合，其尖端的 Tip 复合物在猎物检测、菌毛聚合和杀伤猎物中发挥关键作用。不同的 Tip 复合物具有部分冗余功能，且其活性受环境影响。此外，Kil 菌毛与 “无针” T3SS * 协同作用，实现猎物的杀伤和裂解 。研究还发现，类似 Tip 的次要菌毛蛋白不仅存在于捕食性粘细菌中，在其他细菌中也有类似结构，这为进一步研究 Tad 菌毛的功能多样性提供了重要线索。该研究为深入理解细菌捕食行为以及 Tad 菌毛的功能提供了关键信息，有助于揭示微生物间相互作用的奥秘，为相关领域的研究开辟了新的方向。