单分子可视化揭示ECF转运体复合物在ATP诱导下的亚基动态重组机制及其在维生素B12转运中的关键作用

研究人员通过单分子荧光共振能量转移（smFRET）技术，解析了能量耦合因子（ECF）转运体ECF-CbrT在ATP水解驱动下亚基动态解离与重组的分子机制，证实了S组分（CbrT）与ECF模块的周期性解离是维生素B12转运的核心步骤。该研究为理解原核生物必需营养物质的跨膜转运提供了直接证据，并为靶向ECF转运体的抗菌药物设计奠定基础。

　　

论文解读

在微生物生存竞争中，获取微量营养素如维生素B₁₂的能力直接决定其适应性。能量耦合因子（Energy-Coupling Factor, ECF）转运体作为ATP结合盒（ABC）转运蛋白家族的特殊成员，通过独特的模块化结构——由底物特异性S组分（如维生素B₁₂转运蛋白CbrT）与能量转换模块（ECF模块，含EcfA/EcfA'/EcfT）动态组装，实现跨膜转运。然而，关于S组分是否在转运周期中必须解离这一核心问题，长期存在“热棘轮模型”（主张解离）与“构象切换模型”（主张持续结合）的争议。传统研究多依赖静态结构或非生理条件实验，难以捕捉膜环境中真实动态过程。

荷兰格罗宁根大学的研究团队在《Nature Communications》发表研究，首次在脂质体膜环境中实现ECF-CbrT转运体单分子动态观测。通过构建双荧光标记传感器，结合时间分辨荧光显微技术，直接捕获到ATP水解驱动的S组分周期性解离现象，证实动态组装是维生素B₁₂转运的必需步骤。该发现不仅解决了机制争议，还为靶向ECF转运体的抗菌策略提供新视角。

关键技术方法
研究采用基因工程构建半胱氨酸突变体，通过马来酰亚胺反应标记Alexa Fluor 555/647荧光对；利用脂质体重组技术将标记蛋白嵌入E.coli极性磷脂膜；通过全内反射荧光显微镜（TIRF）记录单分子FRET信号，结合脉冲交替激光共聚焦显微镜验证；采用酶偶联法测定ATP水解活性，并通过维生素B₁₂荧光传感器（BtuF488）验证转运功能。

研究结果

FRET传感器设计验证复合物稳定性
通过筛选活性保留的双半胱氨酸突变体（如C-传感器EcfA_K122C-CbrT_A182C），发现无核苷酸状态下复合物FRET效率稳定（0.62），与晶体结构距离一致。脂质体重建后仍保持静态高FRET，证实膜环境中复合物自发组装稳定。

ATP水解特异性触发亚基解离
添加Mg-ATP后，FRET效率分布出现低值峰（0.08），22%轨迹显示高低FR态动态转换，而AMP-PNP或ADP处理无此现象。单向标记实验进一步证实解离后S组分可自由扩散并与其他ECF模块重组，排除荧光各向异性干扰。

维生素B₁₂调节解离平衡但非必需
尽管维生素B₁₂单独存在不影响复合物稳定性，但在ATP存在时显著增加解离态比例（FRET<0.2占比提升）。竞争实验表明底物结合可能降低S组分再结合效率，解释其调控ECF模块分配的生理意义。

ATP浓度依赖性及动力学特征
EC₅₀分析显示ATP浓度与解离程度正相关（EC₅₀=980 μM），与转运实验K_M值（190 μM）匹配。平均结合态停留时间（7-10秒）远超ATP水解周期（~2秒），表明每次水解未必引发解离，提示膜变形可能是限速步骤。

结论与意义
该研究通过单分子技术实证了ECF转运体的“热棘轮模型”：ATP水解通过ECF模块构象变化引发膜变形，迫使S组分周期性解离以完成底物释放。这种机制虽然伴随无效ATP循环（0.5 s^-1），但可能增强稀缺底物（如纳摩尔级维生素B₁₂）的捕获效率。研究为理解模块化转运体的进化适应性提供新范式，其建立的膜环境单分子分析平台可拓展至其他动态膜蛋白研究。鉴于ECF转运体与病原体毒力相关，针对其亚基界面设计的抑制剂或可阻断多种维生素摄取，成为广谱抗菌药物新靶点。