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本文聚焦于同源 E6AP C 末端（HECT）泛素连接酶 Tom1，通过冷冻电镜技术揭示其全长结构及在泛素化过程中的动态变化。研究发现结构泛素对 Tom1 的活性和链特异性至关重要，为理解相关疾病机制提供关键线索，值得关注。
摘要
同源 E6AP C 末端（HECT）泛素连接酶在 DNA 修复、细胞周期调控和蛋白质质量控制等重要途径中发挥关键作用。Tom1 是酿酒酵母（S. cerevisiae）中五种 HECT 泛素 E3 连接酶之一，具有多效性功能。本研究通过冷冻电镜（cryo-EM）对 Tom1 在活性泛素化循环中的结构进行分析，发现其延伸结构域对催化活性有直接贡献，且存在一种非经典的泛素结合位点，该位点协调的 “结构” 泛素有助于 K48 多聚泛素链组装的保真度。
引言
泛素（Ub）作为一种 76 个氨基酸的蛋白质，在真核生物中参与多种细胞过程的调控。泛素转移过程由 E3 泛素连接酶严格调控，其中 HECT 家族的失调与多种疾病相关。虽然已有研究报道了包括 Tom1 直系同源物 HUWE1 在内的全长 HECT 连接酶的结构，但非催化模块如何影响催化作用仍不清楚。Tom1 和 HUWE1 在多种途径中发挥作用，且 Tom1 缺少 HUWE1 中的一些无序区域，更便于机制研究。本研究利用 Tom1 来解析泛素转移的分子机制。
结果
- Tom1 与 HUWE1 具有关键活性共性：通过在酵母中构建 Tom1 缺失模型，发现添加催化活性的 Tom1 或 HUWE1 可挽救生长缺陷，而催化失活的突变体则不能，表明它们作用于保守底物池。体外重组和泛素化实验显示，Tom1 能泛素化孤儿组蛋白，但对重组核小体无活性，进一步证明其在孤儿质量控制中的作用。
- Tom1 结构揭示保守环架构：Tom1 的结构在其直系同源物中高度保守。通过 cryo-EM 确定的全长 Tom1 结构显示，它形成与人类 HUWE1 相似的 α - 螺旋螺线管组装，具有保守的中央环架构和催化模块。保守分析表明，在 ARLD1 - ARLD4 界面、HECT 催化模块和 N 末端区域存在强保守性。
- Tom1 在活性泛素化过程中的构象变化：在 Tom1 介导的泛素化过程中，通过冷冻淬灭和 cryo-EM 观察到 Tom1 存在多种构象，包括开放、闭合以及与泛素和 E2 结合的复合物。这些构象的变化反映了泛素和 E2 在 Tom1 上的动态结合模式。
- Tom1 N 末端结构域协调泛素：高分辨率的 cryo-EM 结构显示，Tom1 与四个泛素分子和两个 E2 酶结合，其中一个此前未报道的 K48 二聚泛素（ubiquitin site 2）由 Tom1 N 末端 ARLD1 和 HECT 界面协调。这种结合模式通过结构重排影响 Tom1 的催化活性。
- 泛素架构调节 K48 链选择性：破坏 Tom1 与 site 2 泛素的相互作用会影响其对 K48 链形成的选择性，表明 site 2 泛素对 Tom1 的 K48 泛素连接特异性有重要贡献。同时，E2 与泛素的背面相互作用对泛素转移有刺激作用，突变相关位点会影响全长连接酶的活性。
讨论
本研究确定了全长 Tom1 在活性泛素化过程中的结构，发现其 N 末端 ARLD 重复序列协调了一种意外的泛素 - E2 架构，这对链特异性和连接酶活性具有重要意义。结构泛素在调节 Tom1 功能中的作用类似于其他蛋白质的结构功能重编程现象。此外，研究还发现了 Tom1 上的非经典 E2 相互作用位点，这为理解 HECT 连接酶的调控机制提供了新视角。HUWE1 患者的一些突变位于与泛素和 E2 相互作用位点保守的界面上，本研究有助于解释这些突变如何影响 HECT 泛素连接酶的活性。未来还需要进一步的机制研究来深入了解催化循环以及泛素和 E2 架构的作用。
研究局限性
本研究虽然捕获了 Tom1 在活性泛素化过程中的一些构象，但可能遗漏了重要的中间步骤，例如未观察到 Tom1 或 E2 结合泛素的状态。此外，在生化实验中，突变对界面接触的影响是在模型底物上进行的，且未直接观察到底物，无法准确确定第二个 E2 在 Tom1 功能中的作用。
资源可用性
如需进一步信息、资源和试剂，可联系主要联系人 Eric S. Fischer（eric_fischer@dfci.harvard.edu）。本研究生成的试剂可通过材料转移协议从主要联系人处获取。相关数据已存入 EMDB、PDB 和 PRIDE archive 等数据库，可通过相应的 accession codes 获取。
致谢
感谢哈佛冷冻电镜中心和 SBGrid 联盟的支持，以及 Milka Kostic 和 Fischer 实验室成员的讨论和反馈。本研究得到了 The G. Harold 和 Leila Y. Mathers 慈善基金会等的资助。
作者贡献
研究的概念化由 K.W.、M.H.、K.B.、D.O. 和 E.S.F. 完成；方法学由 K.W.、M.H.、K.B.、D.O.、A.S.、C.J. 和 S.S.R.B. 负责；正式分析由 K.W.、M.H.、K.B. 和 A.S. 进行；调查由 K.W.、M.H.、K.B. 和 A.S. 开展；写作 - 初稿由 K.W. 完成；写作 - 评审和编辑由 S.S.R.B.、M.H.、K.B. 和 E.S.F. 负责；监督由 M.H.、S.S.R.B.、K.B.、K.A.D. 和 E.S.F. 承担；项目管理由 E.S.F. 负责；资金获取由 E.S.F. 完成。
利益声明
E.S.F. 在多家公司担任创始人、科学顾问委员会成员或股权持有人，并为多家公司提供咨询服务。Fischer 实验室和 K.A.D. 也有相关的利益关系。
STAR★Methods
- 关键资源表：列出了研究中使用的抗体、化学试剂、重组蛋白、实验模型、重组 DNA、软件和算法等资源的来源和标识符。
- 实验模型和研究参与者详细信息：包括酵母菌株、昆虫细胞和细菌的培养条件，以及酵母转化的方法。
- 方法细节：描述了质粒构建、抗体使用、体外泛素化测定、蛋白质表达和纯化、样品制备和数据收集、数据处理和分析等实验方法的具体细节。
- 量化和统计分析：介绍了 LC - MS 泛素连接分析中的量化方法和统计分析方法。
