重大发现！TORC1 通过 Rag GTPase 系绳 Tco89 自主调控空间分区的关键机制

本文聚焦于真核生物中雷帕霉素复合物 1（TORC1）的调控机制。研究发现酵母中 TORC1 可通过 Rag GTPase 系绳 Tco89 控制其空间分区，影响氨基酸信号传导。该成果有助于深入理解细胞生长代谢调控，为相关疾病研究提供新方向。

　　

引言

真核细胞进化出复杂的信号通路来感知和响应环境变化，雷帕霉素复合物 1（TORC1，在哺乳动物中为 mTORC1，在酵母中为 TORC1）是细胞生长和代谢的关键调节节点。它整合多种信号，尤其是氨基酸信号，协调合成代谢和抑制分解代谢。mTORC1 失调与多种人类疾病相关，如癌症、肥胖症、2 型糖尿病和神经退行性疾病等。

TORC1 由多个亚基组成，在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，其包含 Tor1（或 Tor2）、Kog1（Raptor 的同源物）、Lst8 和酵母特异性的 89-kDa 亚基 Tco89。Tco89 虽最初在筛选渗透胁迫相关甘油摄取缺陷时被发现，且对维持细胞完整性很重要，但它在 TORC1 中的精确作用一直不明确。

TORC1 在真核生物的溶酶体 / 液泡和内体表面发挥作用，与保守的异二聚体 Rag GTPases（哺乳动物中的 RagA/B 与 RagC/D 结合，酵母中的 Gtr1 与 Gtr2 结合）相互作用。这些异二聚体又与相应的复合物（哺乳动物中的 Ragulator 复合物或酵母中的 EGO 三元复合物）结合，定位在膜上。Rag GTPases 在活性状态和非活性状态之间循环，受 GTP 酶激活蛋白（GAP）复合物的调控，从而整合不同的氨基酸信号。在哺乳动物中，氨基酸激活 mTORC1 的机制已较为清楚，但在酵母中，Rag GTPase 介导的 TORC1 调控机制在很大程度上仍未明确。本文旨在揭示酵母中 Tco89 在 TORC1 调控中的作用机制。

结果

1. TORC1 抑制 Tco89 的蛋白水解：研究人员发现，TORC1 可直接磷酸化 Tco89，体内实验中，用 λ 磷酸酶处理免疫纯化的 Tco89-HA₃会导致其 SDS-PAGE 迁移率增加，且该迁移率变化可被 λ 磷酸酶失活阻止。氨基酸饥饿或用雷帕霉素处理细胞会导致 TORC1 失活，同时 Tco89-HA₃的 SDS-PAGE 迁移率增加且丰度下降，而其他核心 TORC1 亚基不受影响。这种 Tco89-HA₃的减少不是由转录调控引起的，而是由于其快速蛋白水解。进一步研究表明，Tco89 的降解是由 20S 核心蛋白酶体（CP）介导的，且不依赖于赖氨酸泛素化。此外，重新添加谷氨酰胺可使 Tco89-HA₃恢复到正常水平，且该过程需要从头合成蛋白质。这些结果表明，TORC1 通过磷酸化保护 Tco89 免受蛋白酶体依赖的降解。
2. TORC1 通过 Tco89 磷酸化促进自身功能：为了验证 TORC1 介导的 Tco89 磷酸化对其稳定性的影响，研究人员构建了表达野生型（WT）Tco89、23 个磷酸化位点突变为丙氨酸（23A）或磷酸模拟谷氨酸（23E）的tco89Δ菌株。结果显示，23A 突变体的 Tco89-HA₃蛋白水平显著降低，而 23E 突变体的蛋白水平显著升高，且 23E 突变体对雷帕霉素更敏感。在氨基酸饥饿条件下，23A 突变体的 Tco89-HA₃水平进一步降低，而 23E 突变体不受显著影响。此外，23E 突变体与 GFP-Tor1 的结合增强，导致 TORC1 功能受损，细胞的 CLS 增加。而 23A 突变体在谷氨酰胺再喂养时，Tco89 水平恢复和 Sch9-Thr⁷³⁷再磷酸化存在缺陷。这些结果表明，TORC1 介导的 Tco89 磷酸化和稳定对 TORC1 向 Sch9 的有效再激活至关重要。
3. Rag GTPases 是 Tco89 蛋白水解所必需的：研究发现，Rag GTPases（gtr1Δ gtr2Δ双突变体）缺失会降低 TORC1 活性，但却增加了磷酸化 Tco89 的水平，且在氨基酸饥饿时，Tco89 的降解受到部分抑制。表达无活性的、核苷酸自由的 Gtr1^S20L的细胞表现出与gtr1Δ gtr2Δ细胞相似的表型。此外，Pib2 作为另一个 TORC1 调节因子，其缺失会降低 TORC1 对 Sch9 和 Tco89 的活性，导致 Tco89 水平降低。通过酵母双杂交实验发现，Rag GTPases 与 Pib2 存在相互作用，且这种相互作用受 Gtr1 核苷酸状态的调节。这些结果表明，Rag GTPases 通过正确定位 Pib2、TORC1 和 Sch9，使 Pib2 能够调节 TORC1 介导的 Sch9 磷酸化。
4. Tco89 的结构化 C 末端结构域保证正常的 TORC1 信号传导：基于 Tco89、Pib2 和 Rag GTPases 之间的遗传相互作用，研究人员推测它们协同作用将 TORC1 锚定在液泡膜上。通过多种实验方法，发现 Tco89 的 C 末端结构域（包含四个 α 螺旋）与 Rag GTPases 和 Kog1 存在相互作用。表达 HA₃标记的 Tco89^585?799的细胞在氨基酸饥饿时能保持稳定，且 TORC1 活性正常，仅表现出轻微的雷帕霉素敏感性和 GFP-Tor1 在信号内体上的部分积累。这表明 Tco89 的结构化 C 末端结构域足以确保适当的 TORC1 控制。
5. Tco89 将 TORC1 系在 Rag GTPases 上：为了研究 Tco89 在介导 Kog1 与 Rag GTPases 结合中的作用，研究人员对 Tco89 进行了突变。突变 Tco89 α 螺旋 1 中与 Rag GTPase 结合的关键残基（SRTQK 突变为 AAAAA），导致 Tco89 与 Rag GTPases 的结合受损，细胞表现出类似于 Rag GTPase 缺失的表型，包括 TORC1 活性降低、对雷帕霉素敏感以及 Tco89 和 GFP-Tor1 的重新定位。突变 Tco89 与 Kog1 结合的残基（EREND 突变为 AAAAA），导致 Tco89 与 Kog1 的结合缺陷，Tco89 蛋白水平显著降低，TORC1 活性极低，细胞对雷帕霉素高度敏感。这些结果表明，Tco89 的结构化 C 末端结构域作为分子钳，将 TORC1（通过 Kog1）和 Rag GTPases 聚集在液泡膜上。
6. Tco89 蛋白水解诱导 TORC1 与液泡底物的空间分离：研究发现，Tco89 缺失或 Rag GTPases 缺失会导致 GFP-Tor1 从液泡膜重新分布到信号内体，Pib2 也会重新定位到这些内体上。在氨基酸饥饿时，TORC1 会从液泡膜重新分布到信号内体，与 Pib2 共定位。表达稳定的 Tco89^23E变体可恢复 GFP-Tor1 在pib2Δ细胞中的液泡定位。这些结果表明，Tco89 的缺失或降解会破坏 Rag GTPase 介导的 TORC1 与液泡膜的结合，导致 TORC1 与液泡效应器（如 Sch9）分离，并促进 TORC1 和 Pib2 在营养丰富条件下在 PI3P 丰富的内体上聚集。
7. Tco89 敏感的磷酸化蛋白质组：通过定量磷酸化蛋白质组学分析，研究人员比较了 WT 和tco89Δ细胞在有氨基酸和氨基酸饥饿条件下的磷酸化位点。结果发现，在 WT 细胞中，有 1757 个位点的磷酸化对氨基酸饥饿敏感，其中 415 个是已知的 TORC1 调节的、对雷帕霉素敏感的位点。在这些位点中，123 个（27%）在tco89Δ细胞中也表现出磷酸化改变，且这些位点主要富集在液泡蛋白中。此外，研究还发现了 6 个位于内体 TORC1 底物 Atg13 中的磷酸化位点，以及 Pib2 的磷酸化对雷帕霉素处理和氨基酸饥饿有显著响应，但 Tco89 缺失对 Pib2 的磷酸化没有显著影响。这些结果表明，Tco89 特异性地影响营养丰富条件下的 TORC1 信号传导，且 TORC1 可能在不同的亚细胞位置靶向不同的底物。

讨论

在酵母中，氨基酸饥饿会导致 Rag GTPase 异二聚体从活性状态转变为非活性状态，但这种转变与 TORC1 效应器的差异磷酸化之间的机制联系尚不清楚。本文研究表明，活性 Rag GTPases 通过与 Tco89 相互作用，将 TORC1 定位在液泡膜上，使其能够被 Pib2 调节，并接近底物 Sch9。在氨基酸饥饿时，Pib2 介导的 TORC1 激活被取消，导致 Tco89 低磷酸化和降解，进而使 Rag GTPases 失活，无法与 Tco89 相互作用。这解释了为什么在氨基酸补充时需要重新激活 Rag GTPases 以结合新合成的 Tco89。这种机制类似于哺乳动物的经典 TORC1 途径，其中 Rheb 作为膜锚定的 Rag GTPase-mTORC1 的变构调节剂。

与哺乳动物不同，酵母中的 Kog1 没有 Raptor 的 “Raptor claw” 结构域，Tco89 在酵母中发挥了类似的功能，且 TORC1 直接控制 Tco89 的水平，将细胞氨基酸可用性与 TORC1 的空间分布联系起来。Tco89 在氨基酸饥饿细胞中的降解伴随着 TORC1 重新分布到信号内体，这有效地将 TORC1 与其液泡效应器 Sch9 分离，但 TORC1 仍存在于信号内体上，可能在营养补充时准备使 Atg13 失活。这些协调过程有助于真菌在波动的营养条件下节约能量。此外，mTORC1 也被证明可以自动调节其在溶酶体的驻留，这表明通过自动调节来动态控制亚细胞定位可能是真核生物调节 TORC1 信号传导的保守策略。

研究的局限性

尽管本研究取得了重要进展，但仍存在一些局限性。目前，TORC1 在缺乏 Tco89、Rag GTPases 或 Pib2，或在氨基酸饥饿时从液泡膜重新定位到信号内体的精确机制尚不完全清楚。研究人员推测这可能与 PI3P、PI (3,5) P₂和其他磷酸肌醇（PIPs）在液泡和内体膜之间的分布改变有关，这些改变由 TORC1 自身调节，通过磷酸化 Fab1 来促进 PI3P 向 PI (3,5) P₂的转化。Kog1 与 PIPs 的结合可能在这一过程中起重要作用，但对 Kog1 中与 PIPs 结合区域的突变尝试导致 Kog1 失去功能，使得研究该区域的结构基础变得困难。因此，阐明 TORC1 在内体上的富集机制以及相关的分子机制将是未来研究的重要方向。