基于多电极阵列的人诱导多能干细胞衍生感觉神经元分析用于镇痛药筛选：开启疼痛治疗新征程

这篇研究利用人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的伤害感受器，结合多电极阵列（MEA）构建高通量筛选平台。该平台可识别外周镇痛药，筛选 704 种天然化合物发现 39 个潜在靶点，为镇痛药研发提供新途径，助力解决慢性疼痛难题。

　　

研究背景

慢性疼痛影响全球约 15 亿人，严重降低生活质量，还常引发焦虑、抑郁等情绪障碍。传统阿片类药物虽有一定疗效，但存在耐受性、依赖性和成瘾性等问题。目前镇痛药研发效率低，主要依赖啮齿动物模型，结果难以转化到人体。许多慢性疼痛与背根神经节（DRG）中过度活跃的外周伤害感受器有关，针对外周神经系统（PNS）开发镇痛药，可减少中枢神经系统（CNS）干预带来的副作用。人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的感觉神经元，在模拟 DRG 生理和反应性方面有独特优势，能克服传统模型的局限性，为镇痛药筛选提供新方向。

研究目的

本研究旨在构建基于 hiPSC 衍生伤害感受器的高内涵筛选（HCS）平台，用于外周镇痛药筛选。通过优化实验条件，评估平台可靠性，鉴定伤害感受器功能特性，筛选天然化合物，为镇痛药研发提供新方法和潜在靶点。

实验方法

1. 细胞培养与实验准备：使用 Anatomic 公司的 RealDRG（hiPSC 衍生伤害感受器），其由人 iPSC 系 ANAT001 经特定分化方案制备。实验选用 48 孔和 96 孔 Axion 多电极阵列（MEA）板，对 MEA 板进行 Poly-L-Ornithine 和 iMatrix-511 SILK 涂层处理，以促进细胞黏附和生长。将 hiPSC 伤害感受器解冻、计数后，接种到 MEA 板中，不同孔设置不同细胞密度，培养过程中定期换液。
2. 指标检测与数据分析：通过 MEA 记录细胞电活动，包括总尖峰计数、平均放电率和阻抗等指标，以此评估细胞活性和功能。利用 Z′和稳健 Z′因子评估检测方法的可靠性，Z′因子计算公式为，稳健 Z′因子计算公式为，其中μc+、μc? 分别是阳性和阴性对照的平均值，σc+、σc?分别是阳性和阴性对照的标准差，MADc+、MADc?是阳性和阴性对照的中位数平均偏差，Mc+、Mc?是阳性和阴性对照的中位数。通过转录组分析确定相关基因的表达情况。在药物处理实验中，使用多种已知的镇痛药和调节剂处理细胞，观察细胞反应，并用统计方法分析数据。

实验结果

1. 优化培养条件提高活性电极率：实验发现，在不同密度下培养 hiPSC 伤害感受器，2 周后除 2000 细胞 / 孔的组外，其他组活性电极率（AEY）均达到 100%；96 孔板中，15000 和 35000 细胞 / 孔的组在 2 周后 AEY≥90%。高 AEY 超过了 MEA 筛选的最低阈值，表明优化后的培养条件和技术有效。
2. MEA-hiPSC 伤害感受器平台可靠性验证：评估检测方法质量时发现，原始电极数据多为非正态分布，经对数转换后部分数据仍不满足经典 Z′因子 “良好检测” 阈值（0.5），但稳健 Z′值在所有细胞密度下均超过 0.5。以孔为单位分析数据时，数据呈正态分布，且在部分细胞密度下稳健 Z′因子超过 0.5。综合考虑，选择以孔为单位的数据进行后续实验，证实该平台在检测神经元活动变化方面具有可重复性和敏感性。
3. 多种离子通道和受体功能验证
   • 电压门控钠通道（VGSCs）：TTX 可完全抑制细胞自发活动，Nav1.7 和 Nav1.8 通道的功能分别通过 GX201 和 HWTX-IV、A887826 得到验证，转录组分析也证实了这些通道相关基因的表达。
   • 电压门控钙通道（VGCCs）：Mibefradil（T 型抑制剂）和 Nifedipine（L 型抑制剂）可显著降低细胞活性，而 N 型抑制剂 ω-conotoxin GVIA 无明显作用，转录组分析显示 L - 和 T 型钙通道基因有强表达。
   • 钾通道：Retigabine（Kv 激动剂）和 Diazoxide（Kir 激动剂）可降低细胞活性，转录组分析证实了相关通道基因的表达。
   • 其他受体：AMPA/kainite 受体拮抗剂 DNQX 和 TRPV1 受体拮抗剂 capsazepine 可显著降低细胞活性，GABA 也可抑制细胞活性，但 NMDA 受体拮抗剂 APV 和 mu - 阿片受体（MOR）激动剂 DAMGO 无明显作用。
   • 激酶：Dasatinib（广谱激酶抑制剂）和 Baricitinib（JAK1/2 抑制剂）可显著降低细胞活性，而 MNK1/2 抑制剂 eFT-508 无明显作用，转录组数据验证了这些激酶的高表达。
   
   
4. 临床 “超说明书用药” 验证与天然化合物筛选：Duloxetine 和 Amitriptyline 这两种用于神经病理性疼痛的临床 “超说明书用药”，能有效抑制 hiPSC 伤害感受器的活性。从 704 种天然化合物中筛选出 224 种可降低细胞活性的化合物，经洗脱实验，39 种化合物显示出可恢复神经元活性，被认为是有潜力的镇痛药候选物。

讨论

本研究构建的 hiPSC 伤害感受器与 MEA 技术结合的平台，为镇痛药筛选提供了更具生理相关性的体外系统。该平台克服了传统模型的局限性，如动物模型的伦理问题和个体差异，以及原代细胞的稀缺性和获取困难等。实验中优化的培养条件和检测方法，提高了平台的可靠性和有效性。通过对多种离子通道、受体和激酶的研究，明确了这些靶点在疼痛信号传导中的作用，为镇痛药研发提供了理论依据。筛选出的天然化合物为进一步开发新型镇痛药奠定了基础，同时也展示了该平台在发现潜在药物方面的潜力。

然而，该研究也存在一定局限性。MEA 检测主要依赖细胞外尖峰检测，无法检测某些不影响动作电位发放的镇痛机制；hiPSC 伤害感受器虽与人类原代伤害感受器有转录相似性，但部分转录标记的靶点可能无功能；细胞处于基线活跃状态，可能影响药物筛选结果的准确性。未来研究可进一步优化检测方法，深入探究细胞功能与转录组的关系，以提高平台的性能和筛选效率。

综上所述，本研究开发的 HCS 平台为镇痛药发现提供了新途径，有望加速安全有效的疼痛治疗药物的研发进程。