双链RNA亲和层析技术高效清除mRNA免疫原性副产物的机制与应用研究

（编辑推荐）本研究创新性开发dsRNA特异性亲和树脂（AVIPure dsRNA Clear），通过亲和层析技术实现>100倍dsRNA清除率（最低达0.00007% w/w），结合优化体外转录（IVT）工艺，使标准核苷酸合成的mRNA完全消除先天免疫反应。相比传统纤维素/乙醇纯化和反相高效液相色谱（RP-HPLC），该技术无需修饰核苷酸（如N1-甲基假尿苷）即可获得更优的蛋白表达效率和细胞健康度，为RNA疫苗/ therapeutics提供可放大的生物工艺解决方案。

　　

双链RNA副产物的挑战与清除策略
单链RNA（ssRNA）作为新型疫苗和治疗剂的核心成分，其体外转录（IVT）过程中产生的双链RNA（dsRNA）副产物会通过Toll样受体（TLR-3）和RIG-I样受体激活干扰素信号通路，引发炎症反应并抑制蛋白表达。传统纯化方法如纤维素吸附（需1L浆料/120mg RNA）和RP-HPLC（载量仅0.017mg/mL）存在溶剂毒性、操作复杂等问题，且需依赖修饰核苷酸才能完全消除免疫原性。

新型亲和树脂的突破性性能
研究团队采用含双链螺旋特异性配体的AVIPure dsRNA Clear树脂，通过柱层析实现3.4g RNA/L_resin的高载量纯化。免疫印迹（J2抗体）和ELISA检测显示：

• 对商业GFP mRNA实现270倍dsRNA清除（0.08%→0.0003%）
• 优化IVT产物经纯化后dsRNA低至0.00007%，较标准IVT产物低8.3倍
• 毛细管电泳（CE）揭示洗脱组分含150-1000bp的dsRNA片段，包括2400nt环状转录产物

细胞水平验证关键优势
在A549-Dual报告细胞系中，亲和纯化RNA展现出：

• 干扰素信号完全沉默（与未处理组无显著差异）
• 24小时GFP表达强度提升2倍
• 细胞存活率提高至95%以上（SYTOX RED检测）
  值得注意的是，即使标准核苷酸制备的RNA，其免疫原性也优于修饰核苷酸+RP-HPLC组合方案，这为规避N1-甲基假尿苷导致的移码突变风险提供了新选择。

工业化应用前景
该技术采用6M盐酸胍（GuHCl）洗脱和常温操作，兼容生物工艺消毒程序。分析型色谱（HP-SEC）显示纯化后11bp dsRNA杂质峰消失，而RP-HPLC在2.5-3分钟洗脱区的微小差异印证了该方法对痕量dsRNA的精准捕获能力。研究者强调，结合IVT工艺优化（如高温转录、盐浓度调节）与亲和层析的"双管齐下"策略，是实现临床级RNA药物安全性和经济性的关键突破。