编辑推荐：
本文聚焦链霉菌（Streptomyces）与其他放线菌的相互作用。研究发现 lydicamycins 可诱导 Kitasatospora sp. P9-2B1 等产生形态分化。运用多组学技术，明确其作用机制。该研究为揭示微生物间化学信号交流及生物活性代谢物生态功能提供依据。
引言
链霉菌（Streptomyces）是临床抗生素的重要天然来源，能产生约 70% 的临床抗生素 。但目前对链霉菌次生代谢物（secondary metabolites，SMs）在生态方面的研究滞后。虽然已有研究关注微生物间的相互作用，如链霉菌与真菌、链霉菌与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的相互作用，但对 SMs 在放线菌相互作用中的角色了解甚少。
孢子形成是链霉菌相互作用中常见的表型变化，但引发这一变化的 SMs 却鲜少被研究。在筛选链霉菌 - 放线菌抗菌作用时，研究人员发现一株环境菌株（Streptomyces sp. P9-2B2）能诱导另一株菌株（Kitasatospora sp. P9-2B1）产生一波孢子形成浪潮。本研究综合运用质谱成像（Mass spectrometry imaging，MSI）、分子遗传学和生物学测试等方法，探究其中的作用机制。
材料与方法
- 选择性分离和基因组学：研究中所用的环境分离株均来自 2020 年在丹麦耶格斯堡鹿园（J?gersborg Deer Park）采集的土壤。通过标准技术进行选择性分离，获取放线菌及链霉菌。利用免费生物信息平台 Type Strain Genome Server（TYGS）对基因组序列数据进行分析，以确定菌株分类。P9-2B1 和 P9-2B3 被鉴定为 Kitasatospora papulosa，P9-2B2 和 P9-2B4 被鉴定为 Streptomyces platensis。同时，将 Kitasatospora sp. P9-2B1 和 Streptomyces sp. P9-2B2 的基因组序列存入 BioProject PRJNA985726。
- 放线菌共培养和单培养：将所有孢子储备液标准化至 105 CFU/mL，每次接种 10 μL。共培养在 BD Difco 马铃薯葡萄糖琼脂（Potato Dextrose Agar，PDA）上进行，菌株间距 1.5 cm。用于 MSI 的接种物在 30°C 孵育 7 天，用于延时成像的接种物置于 30°C 培养箱，用 Reshape Timelapse Imager 每隔 60 分钟拍摄一次，持续 7 - 10 天。在涉及纯 lydicamycin 的实验中，先将细菌孢子接种并预孵育 3 天，再在距离 1.5 cm 的琼脂孔中添加纯代谢物。此外，对 P9-2B2 进行单培养，每天取一个平板，用显微镜观察并提取样本。
- lydicamycin 生物合成基因簇（Biosynthetic gene cluster，BGC）的失活：为使编码 lydicamycin 聚酮合酶（Polyketide synthase，PKS）第一个模块的核心生物合成基因 lyd60 失活，通过 CRISPR - BEST 碱基编辑技术设计引入终止密码子。构建 pCRISPR - cBEST/lyd60 质粒，依次转化大肠杆菌（E. coli）Mach1 T1 和 ET12567/pUZ8002，最后通过接合实验将质粒导入链霉菌，经 Sanger 测序确认突变体。
- 样品制备和质谱成像：将 10 μL 甘油孢子储备液接种在 4 mm 厚的 PDA 琼脂上进行 MSI 实验。样品制备参考 Yang 等人的方法，观察到受体菌株孢子形成后，用手术刀切取菌落，固定在 Bruker IntelliSlide 上，干燥后进行基质喷涂，再次干燥后用 timsTOF flex 质谱仪在正离子扫描模式下采集数据，数据用 Bruker SciLS 分析并归一化处理。
- 基于质谱的代谢组学：采用琼脂塞法提取用于液相色谱 - 质谱（Liquid chromatography - mass spectrometry，LC - MS）分析的样品。液相色谱在 Agilent Infinity 1290 UHPLC 系统上进行，HRMS 数据在 Agilent 6545 QTOF MS 上采集。原始数据经转换和预处理后，在 GNPS 平台进行分子网络分析，并用 Cytoscape 进行可视化。
- RNA 提取和转录组分析：将 Streptomyces sp. P9-2B2 接种在琼脂平板中心，周围接种 S. coelicolor M1146（n = 4），间距 1.5 cm。在不同时间点（2、4、7、9 天）收集面向中心的一半菌落，提取 RNA。RNA 提取使用 RNeasy Mini kit，去除 DNA 后进行浓度和完整性检测。核糖体 RNA 去除、文库制备和测序由 Novogene Co., Ltd 在 NovaSeq PE150 平台完成。
结果
- 可扩散代谢物诱导 Kitasatospora sp. P9-2B1 孢子形成：在研究放线菌相互作用时，发现 Streptomyces sp. P9-2B2 能诱导 Kitasatospora sp. P9-2B1 产生孢子。P9-2B1 的孢子形成区域从靠近 P9-2B2 的边缘开始，经历底物菌丝色素沉着改变、气生菌丝产生和孢子形成三个阶段。通过距离实验，证实可扩散代谢物是导致 P9-2B1 表型变化的原因。
- 质谱成像揭示 lydicamycin 导致孢子形成：传统的琼脂塞提取和 LC - MS 分析未发现导致孢子形成的候选代谢物，因此采用 MSI 技术。MSI 分析发现，在 P9-2B2 和 P9-2B1 的孢子形成区域存在一些特征性物质，经预测和比对，推测这些物质为 lydicamycins。MSI 不仅检测到已知的 lydicamycins 及其衍生物，还发现了一些新的相关特征物质，通过分子网络分析，推测部分较小的特征物质可能是 lydicamycin 生物合成的分流产物或副产物。
- lydicamycin 产生与气生菌丝产生密切相关：通过 10 天的非靶向代谢组学分析，结合主坐标分析（Principal coordinate analysis，PCoA）和 Pearson r 相关性分析，发现 lydicamycins 和推测的分流产物在第 9 天前产量增加。与显微镜图像对比可知，形态发生和孢子形成与代谢组学的样本分组相关。在 ISP2 琼脂上培养时，P9-2B1 未诱导孢子形成，P9-2B2 也未产生孢子，且 lydicamycin 产量较低，由此推断 P9-2B2 的孢子形成启动了 lydicamycin 的产生。
- lydicamycins 诱导 S. coelicolor 形态发生：将另外两株环境放线菌（Kitasatospora sp. P9-2B3 和 Streptomyces sp. P9-2B4）以及 S. coelicolor M145 和 M1146 与 P9-2B2 共培养，发现 P9-2B3 和 S. coelicolor M1146 表现出与 P9-2B1 类似的表型变化。构建 lyd 缺陷型突变体后，与 P9-2B1 共培养时，P9-2B1 未出现诱导形态发生，且突变体的生长发育延迟。添加纯 lydicamycin 可诱导 P9-2B1 孢子形成，但需要较高浓度和较长时间间隔。
- lydicamycin 暴露增加时，控制气生菌丝的基因表达：对 S. coelicolor M1146 在单培养和共培养下的转录组进行分析，发现第 2 天两者无差异基因。第 4 天共培养时，与发育、细胞包膜应激、sigma 因子和次生代谢相关的基因差异表达，包括 bldD、bldG、chpE、chpH、sapA 等基因以及多个 sigma 因子和调控因子。同时，还观察到与各种应激反应相关的基因差异表达。
- lydicamycins 引发类似细胞壁靶向抗生素的转录反应：第 9 天共培养时，S. coelicolor M1146 一半菌落转变为气生菌丝，与气生菌丝形成、孢子形成相关的基因差异表达，如 bldN、bldM、wblA、ssgA、ssgB、ssgR、spoIIE、whiH 等。此外，还发现细胞包膜应激相关的基因差异表达，包括与细胞壁靶向抗生素应激反应相关的基因，以及与次生代谢、抗噬菌体防御相关的基因差异表达。
讨论
lydicamycin 诱导孢子形成的能力使其在具有类似生态功能的次生代谢物中占据一席之地，它与 goadsporin 更为相似，都具有抗菌和诱导孢子形成的特性。目前，诱导孢子形成的 SMs 报道较少，可能是由于致病性链霉菌数量少，传统药物发现中生物学测试优先级低，以及化合物产量低，难以对多种细菌进行测试。
传统分析技术难以快速鉴定共培养中的代谢物，而 MSI 技术在本研究中展现出独特优势，能够基于空间分布确定潜在候选特征物质。但 MSI 技术也面临拓扑挑战，对于放线菌等丝状微生物的化学成像存在困难，需要改进策略或开发新技术。代谢组学、转录组学和蛋白质组学从不同层面揭示微生物生命活动，整合这些数据有助于更全面地了解 SMs 的产生。
本研究通过基于琼脂的实验装置，利用 MSI 技术有效鉴定出 lydicamycins 是链霉菌共培养中导致形态分化的代谢物，不仅检测到已知的同系物，还发现了新的衍生物。通过构建缺陷型突变体和转录组学分析，进一步明确了 lydicamycins 的作用机制和生态角色，为微生物相互作用研究提供了重要参考。
