探秘亚热带人工林土壤黏菌：时空分布、细菌互作与生态启示

该研究利用 18S rDNA 和 16S rDNA 高通量测序技术，调查了亚热带 4 种人工林土壤暗孢黏菌和细菌的分布及动态变化。发现黏菌群落结构因森林类型和季节而异，确定性过程主导群落组装，且与细菌存在显著协同变化。（Myxomycetes）黏菌研究对理解土壤生态系统功能意义重大。

　　

研究背景

土壤黏菌（Soil myxomycetes）是土壤原生生物的重要组成部分，在生态系统中发挥着分解有机物、刺激微生物活动、调节微生物群落和促进养分循环等关键作用。然而，目前人们对其在人工林生态系统中的多样性模式，以及与食物（如细菌）之间的相互作用了解十分有限。以往对黏菌多样性的研究多集中在原始森林生态系统，对受人类活动影响较大的人工林关注较少。本研究旨在深入探究亚热带人工林土壤暗孢黏菌的多样性和生态学特性，解答森林类型和季节如何影响暗孢黏菌群落结构和组装、哪些环境因素起主要作用，以及暗孢黏菌与细菌之间是否存在共变模式等问题。

材料与方法

1. 研究区域、样地设置与采样：研究在江苏南京紫金山国家森林公园的人工林开展，这里属亚热带季风气候。选取了 4 种具有代表性的森林类型，分别是栓皮栎（Quercus variabilis Blume）为主的阔叶林（Broad-leaved forest，BF）、马尾松（Pinus massoniana Lamb.）为主的针叶林（Coniferous forest，CF）、枫香（Liquidambar formosana Hance）和马尾松混交的针阔混交林（Mixed coniferous and broad-leaved forest，CBF），以及糙叶树（Aphananthe aspera (Thunb.) Planch.）和四蕊朴（Celtis tetrandra Roxb.）为主的混交阔叶林（Mixed broad-leaved forest，MBF）。每种森林类型设置 5 个 25×25m 的样方，在每个样方内按对角线法采集 5 个 0 - 10cm 深度（去除凋落物层后）的土壤芯，混合成一个样本。于 2022 年 9 月（秋季）、12 月（冬季）、2023 年 3 月（春季）和 6 月（夏季）进行采样，共采集 80 个土壤样本。
2. 环境因子和酶活性测定：土壤样本经风干后，采用标准方法测定土壤含水量（Soil water content，SWC）、pH、总碳（Total carbon，TC）、总氮（Total nitrogen，TN）等理化性质，以及有效磷（Available phosphorus，AP）、有效钾（Available potassium，AK）、土壤电导率（Soil electrical conductivity，EC）、土壤有机质（Soil organic matter，SOM）等指标。同时，使用试剂盒分别测定土壤中蔗糖酶（S-SC）、纤维素酶（S-CL）、酸性蛋白酶（S-ACPT）和酸性磷酸酶（S-ACP）的活性。
3. DNA 提取与测序：利用 MagPure Soil DNA LQ Kit 提取土壤基因组 DNA，用 NanoDrop NC2000 分光光度计评估其质量和浓度。通过特定引物扩增暗孢黏菌的 18S rDNA V2 区域和细菌的 16S rDNA V3 - V4 区域，对 PCR 产物进行纯化、定量后，在 Illumina MiSeq PE300 平台测序，原始数据存入 Sequence Read Archive 数据库。
4. 序列处理：对原始测序数据进行预处理，去除模糊碱基和低质量序列，然后进行序列拼接。使用相关工具过滤掉含 N 碱基、单碱基重复过多和长度过短的序列，去除嵌合体序列。根据序列相似性对操作分类单元（Operational taxonomic units，OTUs）进行聚类，对黏菌和细菌分别设定不同的相似性阈值，并过滤掉低丰度 OTUs。通过与已知序列比对，对黏菌和细菌的 OTUs 进行分类注释。
5. 统计分析：在 R 软件环境中进行统计分析。为研究森林类型和季节的影响，设置了森林类型比较和季节比较两组分析。采用单因素方差分析（ANOVA）和最小显著差异法（LSD）比较土壤理化性质和酶活性；用相关方法分析黏菌 OTU 分布、计算多样性指数；通过计算 Morisita-Horn 相似性指数（MH）和主坐标分析（PCoAs）评估 β 多样性；运用 Sloan's 中性群落模型和归一化随机性比率量化群落组装过程；借助 Mantel 检验和结构方程模型（SEM）分析环境驱动因素；通过线性回归分析、共惯性分析等探究黏菌与细菌的相互作用。

研究结果

1. 土壤理化因子和酶活性概述：不同森林类型土壤均呈酸性。CF 的 SWC 最高，BF 的 EC 显著高于其他森林，MBF 的 TC 和 SOM 含量较高。土壤理化性质除 TN 外，大多随季节显著变化，夏季 SWC、EC 和 AK 达到峰值，秋季 pH 和 AK 最高，冬季 TC 最高，春季 SOM 最高。土壤酶活性也呈现季节性变化，不同酶在不同季节活性最高。
2. 黏菌群落组成和 α 多样性：研究共鉴定出 458 个黏菌 OTUs，包括 84 个绒泡菌目（Stemonitales）和 374 个变形菌目（Physarales）OTUs，部分 OTUs 注释到属 / 种水平，其中Didymium的 OTU 丰富度最高。不同森林类型和季节的黏菌 OTU 组成存在差异，森林类型间 α 多样性无显著差异，但 BF 的 OTU 丰富度显著高于 CF；季节间 α 多样性差异显著，夏季 OTU 丰富度和 Shannon 指数最高，秋季 Pielou 均匀度指数最高 。
3. 黏菌群落 β 多样性：基于 Morisita-Horn 相似性指数和 PCoA 分析，发现不同森林类型和季节的黏菌群落组成相似度较低。CF 和 MBF 的群落相似度相对较高，BF 和 CBF 的样本在 PCoA 排序中较为分散；春季和冬季的群落相似度较高，春季样本在 PCoA 排序中更集中，而夏季、秋季和冬季样本分布较广。PERMANOVA 分析证实了森林类型和季节对群落组成的显著影响。
4. 黏菌群落组装过程：Sloan's 中性群落模型的 R²值表明，确定性过程主导黏菌群落组装，不同森林类型和季节中，CBF 和冬季的 R²值相对较高。BF 和夏季的 Nm 值较高，意味着较低的扩散限制和较高的迁移率。修正的随机性比率也显示，确定性选择是群落组装的主要驱动力，各森林类型和季节的修正随机性比率值均低于 0.5。
5. 环境因子与黏菌群落的关系：Mantel 检验发现，土壤黏菌群落与多个环境变量显著相关，如 SWC、TN、AK 等。SEM 分析表明，森林类型和季节通过影响土壤酶活性，进而影响细菌群落，最终对黏菌群落产生间接影响；同时，季节也直接影响土壤理化性质，间接影响黏菌群落。
6. 黏菌与细菌的潜在相互作用：线性回归分析显示，黏菌 OTU 丰富度与细菌 OTU 丰富度呈显著负相关，黏菌和细菌的 Pielou 均匀度指数也呈负相关，但 Shannon 指数呈正相关。共惯性分析表明，黏菌和细菌群落存在显著的协同变化。随机森林分析确定了一些对土壤黏菌具有重要预测作用的细菌属，多数显著的黏菌 - 细菌 OTU 对呈负相关，不同黏菌科与不同细菌类群存在特定关联 。

讨论

1. 北亚热带人工林的丰富度和分类组成：本研究使用的引物系统对暗孢黏菌具有高特异性，鉴定出的 OTU 丰富度高于部分地区，与亚热带中国和中国明亮针叶林相当，反映出不同地区土壤黏菌组成差异。属水平上，与以往研究的优势属有所不同，本研究中Didymium等属占主导。物种水平上，注释到的形态种数量超过以往研究，这得益于分类学进展和引物优化。此外，研究还检测到一些嗜雪黏菌，但该地区嗜雪黏菌多样性较低，可能与气候条件有关。
2. 土壤黏菌群落的时空模式：本研究揭示了黏菌群落明显的季节性变化，冬季和春季群落组成相似，夏季 OTU 丰富度和 Shannon 指数最高，秋季 Pielou 均匀度指数最高。这可能与黏菌在不同季节的生长阶段转变有关。与其他研究结果的差异可能源于研究方法和研究地点的不同。在群落组装过程方面，虽然中性过程对黏菌群落有一定影响，但确定性过程占主导地位，这可能是由于采样点的非生物和生物因素的空间异质性导致的。
3. 酶活性对土壤黏菌群落的影响：本研究首次探索了酶活性对黏菌群落结构的影响，发现 S-CL 和 S-ACP 活性与黏菌群落高度相关，暗示黏菌在土壤磷和碳循环中发挥重要作用。然而，酶活性与黏菌群落之间的具体关系和相互作用机制仍有待进一步深入研究。
4. 土壤黏菌与细菌的关系：黏菌与细菌的关系复杂，并非简单的捕食关系，可能存在资源竞争等多种相互作用。共惯性分析显示两者存在显著的生态联系，且这种联系不受森林类型和季节变化的明显影响，但具体作用机制尚不清楚。不同黏菌科与特定细菌类群存在偏好性关联，且多数黏菌 - 细菌 OTU 对呈负相关，这为捕食 - 猎物动态假说提供了支持，但这些相关性的形成原因仍有待进一步探究 。

本研究首次揭示了北亚热带人工林土壤黏菌的群落结构，系统研究了其季节变化规律，并深入探讨了与细菌的潜在相互作用，为深入理解土壤黏菌生态学及其在生态系统中的作用提供了重要依据。