探秘大肠杆菌中外源电子传递链移植效率限制因素：解锁生物能源与修复技术新密码

本文聚焦将希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）的细胞外电子传递（EET）链移植到大肠杆菌（Escherichia coli）的研究。发现移植后电子传递速率大幅下降，明确 Ⅱ 型分泌系统（TIISS）对 MtrC 分泌的关键作用，指出 MtrB 折叠可能是限制因素，为优化生物电化学应用提供思路。

　　

研究背景

在微生物的奇妙世界里，一些微生物具备独特的能力，能将呼吸电子传递给可溶性或不溶性的细胞外电子受体，这一过程被称为细胞外电子传递（EET） 。这一过程意义非凡，比如电子受体铁，作为地壳中第四丰富的元素，常以不溶性铁氧化物或羟基氧化物的形式存在，微生物可将其还原，进而引发一系列重要的非生物氧化还原反应。同时，EET 在生物电化学系统中也有重要应用，微生物能利用固态阳极替代天然不溶性电子受体。

希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）和嗜硫代产乙酸菌（Geobacter sulfurreducens）是研究 EET 过程的重要模式生物，其中希瓦氏菌的相关系统目前了解得最为深入。希瓦氏菌依靠位于周质、内膜和外膜的多血红素 c 型细胞色素网络来还原细胞外电子受体。研究人员推测出一个能使希瓦氏菌进行 EET 的最小蛋白集，包括内膜中的 CymA、周质中的小四血红素细胞色素（STC）、外膜中的 MtrA、MtrC 以及 β - 桶蛋白 MtrB 。

电子从 menaquinone 池经 CymA 传递到周质，再由 STC 传递至外膜表面的 MtrCAB 复合物，从而还原细胞外电子受体。不过，目前对于将希瓦氏菌的 EET 链移植到其他生物，尤其是大肠杆菌（Escherichia coli）中的研究仍在探索阶段。大肠杆菌在生物技术过程中应用广泛，其利用碳源的灵活性高。但此前将希瓦氏菌 EET 链移植到大肠杆菌的尝试，都未能使工程化大肠杆菌的细胞外电子传递速率达到与希瓦氏菌相当的水平，且缺乏直接可比的数据。因此，深入研究这一移植过程中的限制因素至关重要。

材料和方法

1. 载体和菌株构建：研究中使用了多种菌株，包括希瓦氏菌的野生型（WT）、ΔOMCs（所有外膜细胞色素缺失）、suppressor（ΔOMCs MtrAB^s）等，以及大肠杆菌的野生型 DH5αZI、CymA、CymA STC 等不同配置的菌株。通过等温体外重组构建相关载体，利用 CRIM - 整合（conditional - replication, integration, and modular plasmid）促进基因的基因组整合，并通过 Sanger 测序验证构建结果。
2. 细胞培养：大肠杆菌在有氧条件下于溶原肉汤（LB）培养基中培养，或在无氧条件下于添加特定成分的 M9 基本培养基中培养，以甘油为碳源，二甲基亚砜（DMSO）为电子受体，并添加其他营养物质。希瓦氏菌在 LB 培养基或无氧的添加特定成分的 LB 培养基中培养，根据需要添加抗生素。通过添加合适的诱导剂（如 IPTG、AHT、阿拉伯糖）诱导异源蛋白表达，并在适宜温度下进一步孵育。
3. 细胞分级分离：制备膜组分时，将细胞重悬于特定缓冲液中，用 French press 裂解，通过高速离心获得膜组分，再将其重悬于含 Triton X - 100 的缓冲液中。
4. SDS - PAGE 和蛋白质可视化：用 Roti - Quant 测定蛋白质浓度，以牛血清白蛋白（BSA）为标准。采用 12% 的聚丙烯酰胺凝胶，按 Laemmli 方法进行电泳。用考马斯亮蓝染色可视化蛋白质，必要时在考马斯亮蓝染色前通过过氧化物酶染色检测 c 型细胞色素。
5. 血红素定量：依据 Berry 和 Trumpower 的方法进行血红素定量。通过记录样品在氧化和还原状态下的吸光度，计算两者差异，根据特定公式得出血红素含量。
6. 蛋白质免疫印迹分析（Western blot analysis）：将样品与 SDS - loading dye 混合，加热后进行 SDS - PAGE 电泳，再将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，用特异性抗体和碱性磷酸酶偶联的抗兔抗体进行检测。
7. AQDS 还原测定：将细胞预培养至特定 OD₆₀₀值，添加诱导剂孵育后收获并洗涤细胞。在厌氧培养箱中，以甘油为电子供体，蒽醌 - 2,6 - 二磺酸盐（AQDS）为电子受体，通过测量特定时间内的吸光度变化测定 AQDS 还原速率。
8. 柠檬酸铁还原测定：将细胞在特定培养基中预培养，添加诱导剂孵育后收获并洗涤细胞。在厌氧培养箱中，以甘油为电子供体，柠檬酸铁（Fe (III)-citrate）为电子受体，通过细胞悬浮液测定法测定 Fe (II) 含量，用 ferrozine 测定 Fe (II)，并测定蛋白质浓度，计算柠檬酸铁还原速率。
9. 全细胞下拉测定：为检测 MtrC 的分泌情况，利用 SNAP - Capture Magnetic Beads 开发全细胞下拉测定法。将表达 MtrC_snap的细胞与磁珠混合，通过磁性分离结合和未结合磁珠的细胞，用定量 PCR（qPCR）定量结合磁珠的细胞比例。
10. 定量实时 PCR：以加热处理的细菌悬浮液为模板，使用 SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix 进行 qPCR，制备标准品进行校准，用 BioRad CFX Manager 软件分析数据。

研究结果

1. 不同蛋白配置下 AQDS 还原速率在希瓦氏菌和大肠杆菌间差异显著：通过 AQDS 还原测定，研究不同基因工程阶段大肠杆菌和希瓦氏菌的 EET 性能。结果显示，大肠杆菌 DH5αZI WT 的 AQDS 最大还原速率很低，随着 CymA、STC 等蛋白的共表达，还原速率有所增加，但与希瓦氏菌相比仍有很大差距。例如，大肠杆菌 CymA STC MtrCAB₁的最大还原速率为 0.816 ± 0.007 nmol AQDS min^?1 OD₆₀₀^?1，而希瓦氏菌 WT 的最大还原速率高达 246.18 ± 1.69 nmol AQDS min^?1 OD₆₀₀^?1 。同时，对大肠杆菌 CymA STC MtrCAB 的周质和膜组分进行血红素定量，发现其周质血红素含量略高于希瓦氏菌 WT，而膜组分血红素含量仅为希瓦氏菌 WT 的 9% 。
2. 异源表达 TIISS 基因对大肠杆菌中 MtrC 在细胞表面的暴露至关重要：外膜细胞色素如 MtrC 需经内膜和外膜分泌，希瓦氏菌中 TIISS 对 MtrC 分泌起关键作用，缺失 TIISS 重要组分的突变体无法检测到外膜外的 MtrC 。将希瓦氏菌的 TIISS 基因整合到缺乏功能性内源性 TIISS 的大肠杆菌基因组中，构建大肠杆菌_TIISS菌株，并转化相关质粒共表达 MtrC_snap和 PilD 。通过全细胞下拉测定和 qPCR 分析，发现表达希瓦氏菌 TIISS 的大肠杆菌与希瓦氏菌 WT 在 MtrC_snap定位上结果相似，且该大肠杆菌的 AQDS 和柠檬酸铁还原速率均有显著提高，分别是未表达 TIISS 的祖代菌株的 1.4 倍和 2 倍 。这表明希瓦氏菌 TIISS 的特定活性对大肠杆菌中 MtrC 的正确定位至关重要。
3. MtrB 可能是大肠杆菌中柠檬酸铁还原的瓶颈：尽管表达 TIISS 提高了大肠杆菌的还原速率，但与希瓦氏菌相比仍较低。研究人员推测 MtrB 在大肠杆菌中的生产可能导致功能丧失，通过比较希瓦氏菌和大肠杆菌中 MtrB 的折叠和展开行为进行验证。结果发现，希瓦氏菌中未热处理的样品在 Western blot 中无法检测到 MtrB 条带，而热处理后可检测到；大肠杆菌中，未热处理的样品也能检测到 MtrB 条带，且在不同菌株中信号强度不同。这表明 MtrB 在大肠杆菌中的折叠方式可能与希瓦氏菌不同，进而影响 MtrCAB 复合物的结构和功能。

讨论

1. 希瓦氏菌电子传递蛋白的异源表达未能使大肠杆菌获得具有竞争力的还原速率：实验表明，大肠杆菌的细胞外还原速率与希瓦氏菌相比缺乏竞争力。单独或共表达 CymA 和 STC 对大肠杆菌 AQDS 还原速率提升不显著，整合 MtrAB^s模块虽使 AQDS 还原速率有所增加，但仍与希瓦氏菌有较大差距。电子传递到周质可能不是限制因素，且大肠杆菌的总呼吸或生理能力也不是限制因素。因此，MtrB 折叠不正确可能限制了 MtrAB^s的电子传递活性，同时大肠杆菌外膜中相关蛋白浓度较低也可能导致整体还原速率较低。
2. MtrC 和 MtrB 是目前转移希瓦氏菌细胞外电子传递链至大肠杆菌过程中被忽视的瓶颈：尽管在大肠杆菌中异源表达了希瓦氏菌的最小电子传递链组件，但电子传递速率仍无法与希瓦氏菌相比。此前研究虽表明 MtrA、B、C 在希瓦氏菌细胞外电子传递中至关重要，但在大肠杆菌中，MtrC 的正确定位常未被评估，MtrB 的功能也不明确。本研究发现，由于 TIISS 对靶标折叠的特异性识别，MtrC 仅部分通过外膜分泌，共表达 TIISS 虽提高了细胞外还原速率，但仍远低于预期。同时，有证据表明 MtrB 在大肠杆菌中的折叠与希瓦氏菌不同，这可能影响 MtrCAB 复合物的功能。此外，大肠杆菌和希瓦氏菌在膜和脂多糖（LPS）组成上的差异，也可能影响 MtrB 的折叠和功能。

结论

本研究成功证明了在大肠杆菌中异源表达希瓦氏菌的 TIISS 可使末端还原酶 MtrC 成功分泌并正确定位，这使 AQDS 和柠檬酸铁还原速率分别提高了 1.4 倍和 2 倍 。然而，研究也揭示了 β - 桶蛋白 MtrB 在大肠杆菌中的错误折叠可能进一步阻碍整体 EET 性能的提升。为解决这一潜在瓶颈，未来应考虑对大肠杆菌进行更多必要的基因改造研究，探索如何优化电子传递链的移植，以提高生物电化学应用的效率，为生物能源和生物修复技术的发展提供新的思路和方向。