编辑推荐：
本文聚焦新冠病毒（SARS-CoV-2）奥密克戎变异株，发现 NSP6-L260F 替换可增强病毒聚合酶活性，促进病毒复制与致病性，还能补偿 NSP13-M233I 和 NSP14-D222Y 导致的聚合酶活性降低，为理解病毒进化提供新视角。
引言
2019 年底，新冠病毒（SARS-CoV-2）被确定为新冠肺炎（COVID-19）的病原体。2021 年底，奥密克戎变异株出现，其亚变异株在全球持续传播。众多氨基酸替换改变了刺突蛋白的抗原性，非结构蛋白（NSPs）中也检测到一些氨基酸替换，但这些 NSP 替换的作用尚未完全揭示。
SARS-CoV-2 基因组 5′端三分之二包含开放阅读框（ORFs）1a 和 1b，可翻译出 16 种 NSPs，在病毒复制过程中发挥作用。冠状病毒在感染细胞中形成由连接器和双膜囊泡（DMVs）组成的膜结合复制细胞器。DMVs 由 NSP3 和 NSP4 形成，NSP6 是跨膜蛋白，对 DMV 组织以及 DMVs 与内质网（ER）的连接至关重要。NSP6 还被报道可改变病毒致病性，影响奥密克戎 BA.1 的毒力。病毒 RNA 合成在 DMVs 中进行，由 RNA 依赖性 RNA 聚合酶（RdRp，由 NSP12、NSP7 和 NSP8 组成）催化。NSP13 和 NSP14 分别作为 RNA 解旋酶和外切核酸酶 / N7 - 甲基转移酶，与 RdRp 相互作用支持 RNA 合成。
本研究发现，携带 NSP6-L260F 替换的 SARS-CoV-2 在细胞培养条件下反复出现，通过体外和体内实验对该替换进行探究，揭示其对 SARS-CoV-2 奥密克戎变异株特征的影响。
结果
1. NSP6-L260F 替换的识别
在通过反向遗传学拯救复制能力降低的 SARS-CoV-2，或对从 BA.5、BA.4.6、XBB.1.5 感染者临床样本中分离的病毒进行传代时，细胞病变效应在培养细胞中扩散所需时间比平常更长，传播的 SARS-CoV-2 获得了 NSP6-L260F 替换，这暗示该替换可增强病毒复制。在 GISAID 数据库的临床分离株中搜索发现，BE.1.1、BQ.1.1、BQ.1.1 和 XBB.1.16 谱系大多携带该替换。BE.1.1 谱系于 2022 年初出现，其后代 BQ.1 和 BQ.1.1 谱系在 2022 年底迅速传播至多个国家；XBB.1.16 谱系由 XBB.1.5 谱系进化而来，2023 年初在印度战胜其他变异株，表明 NSP6-L260F 可能对病毒在人类中的传播很重要。
2. NSP6-260F 增加病毒体外复制
为评估 NSP6-L260F 对病毒复制的影响，通过反向遗传学构建了 rgXBB.1.5-260L（野生型，WT）和携带 NSP6-L260F 的 rgXBB.1.5-260F。对于 NSP6-260L，使用与临床分离株不同的密码子以避免回复突变。在构建 rgBQ.1.1 相关病毒时，因 rgBQ.1.1-260L 体外复制极慢且获得额外突变，无法拯救出克隆株，其中一株拯救的 rgBQ.1.1-260L 仅携带 NSP9-T21I 额外替换，因此构建了 rgBQ.1.1-260F-NSP9-T21I 和 rgBQ.1.1-260L-NSP9-T21I 用于后续分析。
用不同病毒以感染复数（MOI）0.0001 感染 VeroE6/TMPRSS2 细胞，在感染后 6、12、24 和 48 小时（hpi）测定病毒滴度。结果显示，在 rgXBB.1.5 骨干病毒中，rgXBB.1.5-260F 在 24 和 48 hpi 的病毒滴度高于 rgXBB.1.5-260L；在 rgBQ.1.1-NSP9-T21I 骨干病毒中，rgBQ.1.1-260L-NSP9-T21I 复制效率低于 rgBQ.1.1-260F-NSP9-T21I，且 NSP9-T21I 替换在该条件下不影响病毒复制。
进行竞争实验，将 rgXBB.1.5-260L（WT）和 rgXBB.1.5-260F 或 rgBQ.1.1-260F-NSP9-T21I 和 rgBQ.1.1-260L-NSP9-T21I 按感染滴度等比例混合，以 MOI 0.001 感染 VeroE6/TMPRSS2 细胞。在 24 和 48 hpi 收集上清并深度测序分析，结果表明，到 48 hpi 时，携带 NSP6-260F 替换的变异株在 XBB.1.5 或 BQ.1.1-NSP9-T21I 骨干中均占优势；病毒共感染后每 24 小时传代，携带 NSP6-260L 的变异株在 XBB.1.5 或 BQ.1.1-NSP9-T21I 骨干中的比例分别降至 1% 或 3% 以下。
3. NSP6-L260F 增强仓鼠体内病毒致病性
选用叙利亚仓鼠作为研究 SARS-CoV-2 的动物模型，评估 NSP6-L260F 对致病性的影响。仓鼠经鼻内接种 105 空斑形成单位（PFUs）的不同病毒， mock 感染动物在 6 天实验期间体重增加。感染 rgXBB.1.5-260L（WT）的动物体重未增加，而感染 rgXBB.1.5-260F 的动物在感染后 6 天体重显著下降；rgBQ.1.1-260F-NSP9-T21I 也导致体重下降，但感染 rgBQ.1.1-260L-NSP9-T21I 的动物体重下降幅度明显小于 rgBQ.1.1-260F-NSP9-T21I。
使用全身体积描记系统评估感染仓鼠的肺功能（Penh 和 Rpef），结果显示，rgXBB.1.5 骨干病毒感染的仓鼠 Penh 以及 rgBQ.1.1 骨干病毒感染的仓鼠 Penh 和 Rpef 在各实验组间无显著差异，但 rgXBB.1.5-260F 感染的仓鼠在感染后 3 天和 5 天 Rpef 显著降低，Penh 略有增加。
在感染后 3 天和 6 天，通过空斑试验测量仓鼠鼻甲和肺中的病毒滴度。结果表明，感染后 3 天，NSP6-260F 显著增加了肺和鼻甲中的病毒滴度；感染后 6 天，rgBQ.1.1 骨干病毒感染的仓鼠中未观察到差异，而 rgXBB.1.5-260F 在肺中的滴度显著高于 rgXBB.1.5-260L（WT）。这些结果表明 NSP6-260F 增强了仓鼠体内病毒的复制和致病性，且 NSP9-T21I 可能略微增加病毒致病性，但不显著。
4. NSP6-L260F 促进细胞内病毒 RNA 复制
在 SARS-CoV-2 感染细胞中，RNA 转录和复制在 DMVs 中进行，NSP6 参与 DMVs 与 ER 的连接，可能影响病毒 RNA 复制。通过定量逆转录 PCR（RT-qPCR）检测包膜基因的亚基因组 RNA（sgRNA）表达，以评估病毒转录 / 复制活性。用 MOI 为 1 的各病毒感染 VeroE6/TMPRSS2 细胞，在不同时间点提取总 RNA，测量 E-sgRNA 水平。结果显示，感染 rgXBB.1.5-260F 的细胞中 E-sgRNA 表达高于感染 rgXBB.1.5-260L 的细胞，BQ.1.1 骨干病毒也有类似结果。
使用复制子 DNA 评估聚合酶活性，复制子 DNA 缺少结构蛋白 S、M 和 E 基因，在复制酶和 N 基因之间包含纳米荧光素酶基因。将含 NSP6-260F 或 NSP6-260L 的 XBB.1.5 和 BQ.1.1 骨干复制子 DNA 转染到 HEK293T 细胞中，转染 3 天后测量荧光素酶活性。结果表明，NSP6-260F 在 XBB.1.5 和 BQ.1.1 骨干实验中均显著增强聚合酶活性。
5. 260 位氨基酸替换不影响 NSP6 对干扰素产生和反应的抑制活性
NSP6 除了形成 DMVs 的连接器外，还通过抑制 IFN-β 诱导和 IFN 信号传导来拮抗 I 型干扰素（IFN）反应。为评估 NSP6-L260F 对 IFN 产生和反应的影响，将 BQ.1.1 的 NSP6 或其突变体（N 端带有 FLAG 标签）克隆到哺乳动物表达质粒中。
通过共转染实验评估其对 RIG-I 依赖性 IFN-β 产生的抑制作用。将表达 NSP6 或空载体 pCAGGS、组成型活性人 RIG-I 突变体 pCA-N-Myc-RIG-IN、含 IFN 启动子驱动萤火虫荧光素酶表达的 p125-luc 以及用于标准化转染效率的对照质粒 pGL4.74 [hRluc/TK]（phRluc-TK）共转染到 HEK293T 细胞中，转染 24 小时后测量荧光素酶活性以量化 IFN-β 启动子活性。结果显示，与空载体对照相比，NSP6 抑制 IFN-β 启动子活性，但 NSP6-260F 和 NSP6-260L 之间无差异。
评估 NSP6-260F 和 NSP6-260L 拮抗 IFN 信号传导的能力。将表达 NSP6 或空载体 pCAGGS、含干扰素刺激反应元件（ISRE）启动子驱动荧光素酶报告基因的 pISRE-luc 以及对照质粒 pGL4.74 [hRluc/TK] 共转染到 HEK293T 细胞中，转染 16 小时后用 IFN-α 处理 8 小时，然后测量荧光素酶信号以量化 ISRE 的激活。结果显示，与空载体对照相比，NSP6 抑制 IFN 信号传导，但 NSP6-260F 和 NSP6-260L 之间无差异。这些结果表明 NSP6-L260F 不影响 NSP6 拮抗 IFN 产生和反应的能力。
6. NSP6-L260F 补偿有害突变
NSP6-L260F 虽促进病毒复制，但仅在少数谱系中发现，如 BQ.1.1 和 XBB.1.16。无法拯救出克隆株 rgBQ.1.1-260L，且构建携带 NSP6-260L 的 XBB.1.16 病毒也失败，表明 BQ.1.1 或 XBB.1.16 骨干中的 NSP6-260L 下调聚合酶活性。然而，NSP6-260L 在大多数临床分离株中存在，暗示 BQ.1.1 和 / 或 XBB.1.16 特有的氨基酸替换降低了病毒聚合酶活性。
通过比较 BQ.1.1 和 XBB.1.16 与其密切相关谱系的氨基酸序列，确定候选降低聚合酶活性的替换。BQ.1.1 从 BA.5 经 BA.5.3.1、BE.1 和 BE.1.1 进化而来，NSP6-L260F 替换出现在 BE.1.1 谱系并在其后代 BQ.1.1 谱系中保留，在此过程中获得 NSP2-Q376K、NSP13-M233I 和 N-E136D 替换，NSP13-M233I 可能是导致 BQ.1.1 谱系聚合酶活性降低的候选替换。XBB.1.16 从 XBB.1.5 进化而来，两者有 NSP14-D222Y、S-E180V 和 S-K478R 三个氨基酸差异，NSP14-D222Y 可能是导致 XBB.1.16 谱系聚合酶活性降低的候选替换。
构建含不同 NSP6-260 和 NSP13-233 或 NSP14-222 氨基酸组合的复制子 DNA，比较其体外聚合酶活性。结果显示，在 BQ.1.1 骨干中，NSP13-M233I 显著降低聚合酶活性，NSP6-L260F 可恢复；在 XBB.1.16 骨干中，NSP14-D222Y 显著降低聚合酶活性，NSP6-L260F 也可恢复。生成携带或不携带这些替换的病毒，在 VeroE6/TMPRSS2 细胞中比较其复制能力，结果与复制子实验相似，去除 NSP13-M233I 和 NSP14-D222Y 有害替换显著增加病毒复制，表明 NSP13-M233I 和 NSP14-D222Y 降低病毒复制，NSP6-L260F 可补偿这一影响。
讨论
本研究表明，NSP6-L260F 在体外和体内促进病毒复制，增强体外病毒聚合酶活性。该替换在人类分离株中存在，虽此前有研究提示其处于正选择，但对病毒特征的影响未充分探索。NSP6 对 SARS-CoV-2 复制细胞器的生物发生很重要，NSP6-L260F 可能通过增强与脂滴的相互作用或脂质通量活性，促进 DMVs 中的 RNA 复制。
研究还鉴定出 BQ.1.1 和 XBB.1.16 谱系中降低病毒在 VeroE6/TMPRSS2 细胞中复制的替换，即 NSP13-M233I 和 NSP14-D222Y，它们也降低聚合酶活性，NSP6-L260F 可恢复聚合酶活性，补偿这些有害替换的负面影响。从 BA.5 到 BQ.1.1 的进化过程中，NSP13-M233I 先出现，随后 NSP6-L260F 出现；在 XBB.1 谱系中，NSP14-D222Y 出现早于 NSP6-L260F，支持 NSP6-L260F 可能是为补偿 NSP13-M233I 或 NSP14-D222Y 的有害影响而获得的假设。
NSP6-L260F 增强了病毒在仓鼠体内的致病性，导致更多体重减轻和呼吸功能下降。此前研究发现 NSP6-L260F 与较高住院率相关，感染自然携带 NSP6-L260F 的 XBB.1.16 变异株的住院率显著高于其他奥密克戎变异株，提示 NSP6-L260F 可能增加人类病毒致病性，但因受免疫和社会情况等因素影响，难以评估。此外，NSP9-T21I 可能略微增加病毒致病性，其在病毒致病性中的作用需进一步研究。
NSP13-M233I 和 NSP14-D222Y 在体外下调病毒聚合酶活性，它们增加蛋白质稳定性，NSP14-D222Y 在 XBB.1 谱系中被正选择，表明它们可能在病毒在人类中的生存中具有某些有益作用，尽管它们降低了病毒在 VeroE6/TMPRSS2 细胞中的复制能力。
总之，本研究发现 NSP6-L260F 通过增加聚合酶活性促进病毒体外和体内复制，增强仓鼠体内病毒致病性。同时鉴定出降低聚合酶活性的替换，这些替换可被 NSP6-L260F 补偿。应密切监测 NSP6-L260F 的获得或 BQ.1.1 和 XBB.1.16 中抑制性突变的缺失，因其可能增加病毒致病性。鉴于 NSP6-L260F 促进培养细胞中病毒复制，可用于改进灭活或减毒活疫苗病毒的生产。
材料和方法
- 细胞：VeroE6/TMPRSS2 细胞在含 1mg/mL 遗传霉素（G418）、5μg/mL Plasmocin Prophylactic 的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）和 10% 胎牛血清（FBS）中培养；HEK293T 细胞在含 10% FBS 的 DMEM 中培养，所有细胞在 37°C、5% CO2条件下培养，定期 PCR 检测确认无支原体污染。
- 细菌人工染色体构建：以特定病毒 cDNA 为模板，PCR 扩增跨越 SARS-CoV-2 全基因组的 6 个重叠 DNA 片段，通过引物引导诱变引入 NSP6、NSP13 或 NSP14 突变。将片段与线性
