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这篇研究聚焦肠道微生物群对草酸的代谢。通过宏基因组和系统发育分析，发现草酸代谢相关基因在多种细菌中广泛存在，进化选择发生在基因水平，受细菌系统发育限制。该研究对理解肠道微生物进化及相关疾病防治意义重大。
引言
微生物群与宿主构成的共生体（holobiont）是一个复杂系统，其中肠道微生物群主要在宿主环境中通过微生物间竞争进化，宿主则进化出防御机制防止微生物群过度增殖。肠道细菌的资源主要来源于饮食，因此存在利用饮食营养资源的强大选择压力，这推动了生态和进化过程。生态学和进化领域的重要问题包括选择单位是物种还是基因，以及 specialist 和 generalist 生态策略如何进化，这些都可在基因或物种层面发生。
草酸作为一种植物产生的膳食毒素，可抑制许多肠道细菌生长，但哺乳动物宿主缺乏降解草酸的酶，而部分肠道细菌（如 Oxalobacter formigenes）能利用草酸作为碳源和能源。草酸被吸收进入循环系统后对宿主有害，可导致多种慢性疾病，因此研究草酸代谢对理解微生物 - 宿主进化关系很重要。
肠道细菌降解草酸有多条代谢途径，如 oxIt 基因编码草酸 - 甲酸转运蛋白；frc 和 oxc 基因可将草酸转化为甲酸和二氧化碳等；还有 oxo 基因、oxdD 基因参与的代谢途径。而且草酸代谢的副产物（如甲酸）可作为其他微生物代谢途径的底物，对肠道微生物群产生生态和进化压力。
本研究旨在探讨人类和实验室小鼠肠道微生物群中膳食草酸暴露的进化影响，通过多种宏基因组方法来验证历史草酸暴露驱动基因或分类单元水平进化的假设。
材料和方法
- 比较基因组分析：研究人员分析了来自 35 名泌尿系统结石疾病（USD）患者和 35 名健康对照的鸟枪法宏基因组数据和全长宏基因组组装基因组。数据经过组装、分箱、定向和脚手架搭建等处理，通过量化通用单拷贝基因评估基因组的完整性和纯度。对重建的基因组进行基因提取和注释，筛选草酸降解基因及相关代谢基因，并对基因进行分类。然后将高质量鸟枪法宏基因组数据映射到注释基因组和基因上，生成分类和草酸 / AMSF（OAMSF）途径谱。利用 DESeq2 进行差异丰度分析，使用 Sparcc 算法进行相关性分析，并在 Cytoscape 中可视化网络。
- frc 基因的系统发育分析：基于先前发表的人类和小鼠粪便 DNA 的扩增子宏基因组配对（16S rRNA 和 frc 基因）测序数据进行分析。16S rRNA 基因扩增遵循标准协议，frc 基因使用特定引物进行扩增。序列分别在 dada2 中分配到扩增子序列变体（ASVs），并导入 phyloseq 进行分析。使用 BWA 比对器将 frc 基因 ASVs 映射到 UniRef90 基因数据库进行注释，通过系统发育分析验证注释结果，去除非 frc 注释。利用 BWA 比对器将 frc 基因序列映射到包含大量原核基因组的数据库进行分类注释，16S rRNA 基因则使用 Silva v138.1 SSURef 和 NCBI 16S rRNA 数据库在 dada2 中进行注释。
- frc 基因的分子钟分析：使用 Mega11 软件中的 Reltime 算法构建 frc 基因 ASVs 的系统发育树，以估计基因的相对进化辐射事件。该算法在缺乏校准绝对时间数据时，基于相对分歧事件提供相对时间钟。对所有独特的 frc 基因 ASVs 及 97% 序列同源性聚类后的数据进行 RelTime 分析，同时对配对的 16S 数据进行相同处理，以便比较含 frc 基因的物种和完整微生物组中的物种，评估草酸代谢的冗余性。
- dN/dS 选择压力分析：使用 MEGA - 11 软件计算 frc 基因 ASVs 的非同义替换与同义替换的比率（dN/dS），通过基于密码子的 Z 检验进行选择分析，并进行 FDR 校正以评估基因是否经历正选择（dN/dS > 1）、负选择（dN/dS < 1）或稳定（dN/dS = 1）。
- 序列相似性网络分析：分别将扩增子宏基因组数据和 UniProt 数据库中注释为 frc 基因的蛋白质序列进行映射，生成所有成对的宏基因组 - 宏基因组或 UniProt - UniProt frc 序列同源性数据。通过修剪低于不同序列同源性阈值（50%、60%、70%、80% 和 90%）的同源对来生成网络，并在 Cytoscape 中可视化并按分类注释。
结果
- 人类群体中含草酸或 AMSF 基因的全长基因组比例：基于人类粪便鸟枪法宏基因组测序数据组装的基因组，估计 32.5% 的基因组至少含有一个草酸处理基因。草酸结合蛋白在含草酸处理基因的基因组中占比最多，直接参与草酸降解的基因中，琥珀酰 - CoA 和乙酰 - CoA 转移酶最丰富。草酸处理基因的分布主要沿门水平划分，如 oxit - frc - oxc 途径几乎完全存在于变形菌门（Pseudomonadota），草酸结合蛋白主要存在于厚壁菌门（Baciliota）和拟杆菌门（Bacteroidota）。总体而言，草酸处理基因主要分布在厚壁菌门，其次是拟杆菌门和变形菌门。
相比之下，95% - 98% 的基因组至少含有一个 AMSF 基因，主要分布在厚壁菌门和拟杆菌门。除产甲烷作用外，各功能基因在门水平上的分布与草酸代谢类似。
比较有和没有 USD 的个体，发现两组人群可通过含有 OAMSF 途径的基因组区分开来。健康对照组中映射到含有 OAMSF 途径基因组的读数水平显著高于 USD 患者，且对照组中富含草酸降解基因的 Faecalibacterium 属细菌水平更高。在 Faecalibacterium 基因组重建中，部分基因组含有草酸降解基因，且在对照组中富集的菌株中，多数含有与乙酰 - CoA：草酸 CoA 转移酶途径相关的草酸降解基因。
研究还发现，在鉴定出的 80 个独特 OAMSF 基因中，92% 是单功能基因，而只有 2.6% 的基因组仅含有一种 OAMSF 途径的基因。OAMSF 基因之间形成紧密的共现网络，但多途径基因之间的显著正相关较少。基因组之间总体共现较少，除了那些含有所有或几乎所有 OAMSF 途径基因的基因组。
2. frc 基因的分子钟系统发育：对 frc 基因的高通量测序显示，其 ASVs 几乎都映射到变形菌门，其中超过 25% 的独特 ASVs 映射到 Bradyrhizobium 属基因组。RelTime 系统发育分析表明，Bradyrhizobium 属含有更古老版本的 frc 基因，而 Oxalobacter 属则更为衍生。一些属（如 Bradyrhizobium、Oxalobacter、Streptomyces）似乎只获得了一次 frc 基因并在属内多样化，而 Klebsiella 和 Methylobacterium 等属则多次获得该基因。比较人类和小鼠来源的 frc ASVs 系统发育树，未发现明显界限，表明宿主群体之间可能存在频繁的迁移事件。当 frc ASVs 以 97% 相似性聚类时，独特 ASVs 数量减少，但系统发育树结构和分类关系未改变。通过比较 frc 基因和 16S rRNA 基因的 97% 同源性聚类，估计多达 42.7% 的人类肠道微生物群可能至少含有一个草酸处理基因。
3. frc 基因的 dN/dS 比率：对所有成对 dN/dS 比率的检查表明，frc 基因总体上倾向于正选择，这与分子钟系统发育分析一致。Actinomycetota 和 Bacillota 门之间以及 Bacillota 门内的选择压力最强，Chlamydiota 和 Bacilliota 门之间的选择压力最小。
4. 序列相似性网络：从宏基因组衍生的 frc 基因 ASVs 构建的序列相似性网络在 80% 序列同源性时形成一个连续的簇，随着同源性阈值升高，明显的子簇逐渐分离，且子簇主要沿门水平分类线划分。而从 UniProt 衍生的全长 frc 基因序列构建的网络在较低同源性时就分裂成多个簇，但当 UniProt 序列修剪到扩增子水平时，在 50% 同源性时就出现许多同源簇。
讨论
本研究从生态和进化的角度研究肠道草酸代谢，发现肠道中草酸代谢途径的冗余程度比以前认为的要高，多种由不同基因编码的途径分布在不同的分类群中。草酸代谢基因在肠道 33% - 45% 的物种中分布，表明历史上存在强大的压力促使这种功能的发展，而参与甲酸或二氧化碳代谢的基因在肠道微生物群中的比例超过 95%，显示出更大的选择压力。草酸和甲酸代谢不仅对微生物生态和进化很重要，还具有重要的生物医学意义，如草酸与多种慢性炎症性疾病有关。在之前的研究中发现，USD 患者的草酸和丁酸代谢基因以及 Faecalibacterium 属显著减少，而本研究表明 Faecalibacterium 基因组也含有草酸和 / 或 AMSF 途径的基因，且含有草酸降解基因的基因组在 USD 患者中减少的可能性更大，这表明这些细菌可能通过草酸代谢和丁酸合成来预防 USD。
在基因与分类单元选择的研究中，一方面，基于基因组分析，不同草酸代谢基因在不同门中的分布情况支持分类单元水平选择的假设。另一方面，单功能 OAMSF 基因的共现情况、frc 基因的序列相似性网络分析以及 RelTime 分析等数据表明，草酸暴露促进了基因水平的选择，但基因的辐射受到分类学差异的限制。
此外，研究还对生态专业化或泛化的出现提供了见解。在物种层面，Bradyrhizobium 可利用多种资源，是泛化物种，而 Oxalobacter formigenes 是草酸降解的特化物种。在基因层面，几乎所有研究的基因（92%）只存在于一种 OAMFS 途径中，表明物种层面获取基因支持生态泛化比使现有基因适应多种代谢途径在进化上更容易。
总之，本研究表明肠道微生物群中草酸和甲酸代谢高度冗余，草酸代谢基因跨越不同分类群，但特定基因 / 途径在分类学上受限。分子钟分析揭示了从泛化草酸利用者到生物修复细菌，再到草酸特化者的进化辐射。序列相似性分析表明 frc 基因在肠道中的辐射更多由水平基因转移事件驱动。这些结果支持草酸暴露在基因水平施加选择压力，但基因辐射受分类学限制的假设，为理解肠道微生物群的进化过程提供了重要见解，对开发促进或抑制特定微生物功能的细菌疗法具有生物医学意义。
