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本文聚焦丝状蓝藻（Nostoc punctiforme），发现氰外分选酶 B（CrtB）对其运动、生物膜形成及藻胞外多糖（scytonemin）产生至关重要。通过基因编辑与蛋白组分析，揭示 CrtB 影响 PEP - CTERM 蛋白加工，为理解蓝藻生理及异源合成色素提供关键依据，极具科研价值。
研究背景
丝状蓝藻常具备在固体表面滑行运动的能力，这种运动有助于其扩散到新环境、响应光信号进行趋光迁移，还对与植物建立固氮共生关系、生物膜形成及宏观聚集体的组装意义重大。丝状蓝藻的运动依赖 IV 型菌毛系统和运动相关多糖，在模式丝状蓝藻 Nostoc punctiforme ATCC29133（PCC73102）中，该多糖被称为藻殖段多糖（HPS） 。目前，HPS 的精确化学成分尚未明确，但已知其含有岩藻糖和半乳糖，且其合成相关基因分散于基因组中，多数编码糖基转移酶。不过，HPS 的输出机制仍未完全明晰。
氰外分选酶 B（CrtB）基因位于与 HPS 合成相关的基因座上，它属于外分选酶家族，该家族通常参与革兰氏阴性菌中附着于细胞表面或释放到细胞外的蛋白质的加工过程。被外分选酶加工的靶蛋白含有 N 端信号序列和 C 端 PEP - CTERM 结构域，PEP - CTERM 结构域被认为是外分选酶加工的信号。此外，在蓝藻中，参与天然防晒色素藻胞外多糖（scytonemin）合成的 scy 基因座编码了三个假定的 PEP - CTERM 蛋白，这暗示 CrtB 可能在 scytonemin 的产生中发挥作用。
材料和方法
- 菌株和培养条件：研究使用 N. punctiforme ATCC 29133 及其衍生物，在 Allen 和 Arnon 培养基（AA/4）中培养，根据实验目的调整培养基成分，如添加或去除固定氮源、添加蔗糖或 sucralose 抑制藻殖段形成等。Escherichia coli 在 LB 培养基中培养，选择性生长培养基添加相应抗生素。
- 质粒和菌株构建：通过重叠延伸 PCR 构建用于 crtB 基因框内缺失的质粒 pDDR539 和表达 crtB 的质粒 pGAP100，将质粒导入野生型 N. punctiforme 中构建突变菌株 UOP217。
- 运动性检测：采用平板运动性检测和延时运动性检测两种方法，前者将菌落从抑制藻殖段发育的培养基转移到无蔗糖培养基上培养观察，后者在诱导藻殖段形成后，将菌液滴在培养基上，覆盖盖玻片，定时成像。
- 免疫印迹和凝集素印迹分析：提取 N. punctiforme 细胞总蛋白，进行 SDS - PAGE 凝胶电泳，转膜后用针对 PilA、RbcL 和 HmpD 的多克隆抗体进行免疫印迹检测；通过真空转移将无细胞培养基转移到硝酸纤维素膜上，用生物素化的荆豆凝集素 I（UEA）检测可溶性 HPS。
- 免疫荧光和荧光凝集素染色：固定细胞后，用多克隆 α - PilA 抗体和 UEA - 荧光素分别检测表面 PilA 和细胞相关 HPS。
- HPS 互补检测：收集条件培养基，对合适菌株进行标准藻殖段诱导，用条件培养基重悬细胞，培养后进行延时显微镜观察。
- 生物膜检测：将含有一定量细胞材料的培养液转移到 24 孔板中培养，定期分散大菌落聚集体，培养结束后清洗孔板，拍照并提取附着细胞中的叶绿素 a（Chl a）进行定量分析。
- 外蛋白质组分析：制备用于外蛋白质组分析的条件培养基，经离心、过滤、浓缩后，进行 SDS - PAGE 银染分析或用 SP3 方法消化蛋白质，进行质谱分析。
- 显微镜观察：使用配备不同物镜的 EVOS M5000 荧光显微镜进行明场和荧光观察，根据不同荧光标记选择相应的激发和发射波长。
- 藻胞外多糖（scytonemin）产生检测：通过标准 UVA 诱导试验测定菌株产生 scytonemin 的能力，用 90% 丙酮提取脂溶性色素，在 UV - 可见分光光度计上检测吸光度，计算色素浓度；必要时，通过 HPLC 分离提取物，检测 scytonemin 单体的积累。
实验结果
- crtB 基因座：在 N. punctiforme 中，crtB 基因位于一个包含与 HPS 合成相关基因的基因座上，其上下游分别是编码假定转氨酶和 CrtB 相关蛋白的基因。RNA - seq 和 Cappable - seq（CAPseq）数据分析表明，Npun_F0455 和 crtB 可能作为一个操纵子从 Npun_F0455 上游的 SigJ 依赖启动子共转录，而 Npun_F0457 不太可能与 crtB 共转录。
- CrtB 对运动性至关重要：构建 crtB 基因框内缺失菌株，该菌株在平板运动性检测和延时显微镜观察中均失去运动能力，但能产生形态不同的藻殖段，且免疫印迹和免疫荧光分析显示其主要菌毛蛋白 PilA 和甲基接受趋化蛋白 HmpD 的表达量与野生型相当，表明 CrtB 不影响藻殖段早期发育和 T4P 系统的功能。
- CrtB 影响 HPS 积累和生物膜形成：凝集素印迹分析表明，ΔcrtB 菌株和野生型菌株释放到培养基中的可溶性 HPS 量相当，但 ΔcrtB 菌株细胞相关 HPS 含量显著低于野生型，且其 HPS 在丝状体外的积累也明显减少。HPS 互补实验显示，ΔcrtB 菌株产生的 HPS 不能恢复 HPS 缺陷突变体的运动能力，野生型 HPS 也不能恢复 ΔcrtB 菌株的运动能力，这表明 CrtB 可能影响 HPS 的组成和细胞表面，进而影响 HPS 的粘附和运动性。此外，野生型藻殖段能形成明显的生物膜，而 ΔcrtB 菌株的藻殖段则不能，说明 CrtB 在生物膜形成中起重要作用。
- CrtB 影响外蛋白质组中 PEP - CTERM 蛋白的存在：N. punctiforme 基因组编码 35 个含有假定 PEP - CTERM 结构域的蛋白，其中 7 个在发育中的藻殖段中显著上调。外蛋白质组分析发现，与野生型相比，ΔcrtB 菌株中 PEP - CTERM 蛋白 Npun_F4801 的含量显著降低，其他一些 PEP - CTERM 蛋白的含量也有所减少，而 Npun_R4127 和 Npun_R6196 的含量则增加，这表明 CrtB 参与了 PEP - CTERM 蛋白的分选过程，ΔcrtB 菌株运动性和生物膜形成缺陷可能与细胞外 PEP - CTERM 蛋白的改变有关。
- CrtB 对藻胞外多糖（scytonemin）的产生至关重要：许多蓝藻能产生 scytonemin 以抵御 UVA 辐射，N. punctiforme 中 scy 基因座和 ebo 基因座参与 scytonemin 的合成和运输过程，其中 scy 基因座编码三个假定的 PEP - CTERM 蛋白。研究发现，野生型菌株在 UVA 照射下积累 scytonemin，而 ΔcrtB 菌株在有无 UVA 照射下均无法检测到 scytonemin，且与 ΔscyE 突变体不同，ΔcrtB 菌株在 UVA 诱导下未积累 scytonemin 单体，这表明 CrtB 在 scytonemin 的产生中起关键作用。
讨论
研究提出了一个关于氰外分选酶 B 系统在 N. punctiforme 运动性和 scytonemin 产生中作用的工作模型。在运动性方面，发育中的藻殖段特异性表达的 PEP - CTERM 蛋白经一般分泌途径跨细胞质膜运输，N 端信号肽被切除，PEP - CTERM 结构域将蛋白锚定在细胞质膜上，直至被 CrtB 加工。加工后的蛋白可能通过与 HPS 一起经专用多糖分泌系统跨外膜运输，促进细胞表面与 HPS 的相互作用，从而实现运动。在 scytonemin 产生方面，ScyD、ScyE 和 ScyF 蛋白经 sec 途径分泌到细胞质膜外，由 CrtB 加工，scytonemin 单体在细胞质中合成，经 Ebo 系统运输到细胞质膜外，最终由 ScyE 催化形成 scytonemin。
此外，N. punctiforme 基因组编码的 35 个预测的 PEP - CTERM 蛋白中，部分蛋白的功能仍不清楚，CrtB 系统可能参与其他生物学功能。由于 CrtB 和 PEP - CTERM 蛋白与 EPS 相关过程密切相关，研究 CrtB 系统在其他 EPS 相关表型中的作用，可能有助于揭示其在蓝藻中的更多功能。值得注意的是，约 50% 的蓝藻基因组编码 crtB 的同源物，但一些常用的单细胞蓝藻模型中不存在，而几乎所有丝状菌株中都存在，这反映了含有和不含有 crtB 的蓝藻在生理学上的根本差异。
