北部白犀牛（Ceratotherium simum cottoni）功能灭绝种群的染色体水平基因组图谱构建与干细胞基因组完整性分析

这篇研究报道了功能灭绝物种北部白犀牛（NWR）的首个染色体水平参考基因组CerSimCot1.0，通过长读长测序（ONT）、光学图谱（OGM）和Hi-C技术组装出包含40条常染色体、X/Y性染色体及线粒体基因组的2.5 Gb高质量基因组。研究揭示了NWR与南部白犀牛（SWR）的高度染色体同源性，并建立基于诱导多能干细胞（iPSCs）的基因组完整性评估流程，发现培养过程中出现的30 Mb杂合缺失可能影响人工配子生成。该基因组为濒危物种的干细胞辅助生殖技术（ART）和克隆拯救计划提供了关键分子工具。

　　

Significance
北部白犀牛（NWR）作为功能性灭绝物种，仅存两只无法自然繁殖的雌性个体。研究团队通过诱导多能干细胞（iPSCs）技术尝试拯救该物种，但干细胞培养过程中可能获得的基因组异常会严重影响人工配子的功能性。为此，研究者构建了染色体级别的NWR参考基因组CerSimCot1.0，为评估iPSCs基因组完整性提供了金标准。

Abstract
研究整合牛津纳米孔（ONT）、10X Genomics连锁读长、Hi-C和光学图谱（Bionano OGM）技术，组装出达到脊椎动物基因组计划（VGP）质量标准的高连续性NWR基因组。该基因组揭示了NWR与近亲南部白犀牛（SWR）在染色体层面的高度保守性，同时通过比较iPSCs与源代成纤维细胞的基因组，发现培养过程中出现的染色体5上30 Mb杂合缺失——该区域包含多个减数分裂相关基因和肿瘤抑制因子，提示需严格筛选干细胞系用于人工配子生产。

Results

Assembly of the NWR Reference Genome
以雄性NWR个体"Angalifu"（实验室编号KB9947）的成纤维细胞和iPSCs为材料，采用四步组装策略：1）ONT长读长初步组装；2）10XG连锁读长和OGM支架构建；3）Hi-C数据提升至染色体水平；4）线粒体基因组特异性组装。最终获得的CerSimCot1.0基因组包含40条常染色体（CHR1-40）、完整X染色体（130.6 Mb）、部分Y染色体（11.1 Mb）和16.7 kb线粒体基因组，其中4条染色体（CHR1/11/23/X）实现端粒到端粒组装。

Quality of the NWR Reference Genome
基因组质量评估显示：BUSCO完整性评分在真核生物、脊椎动物和劳亚兽类数据集分别达99.2%、98.0%和95.8%；碱基质量值（QV）达41.3，k-mer完整度91.8%。与VGP标准相比，该基因组在连续性（NG50 3.6 Mb）和缺口数量（160 gaps/Gb）等指标均优于同类项目。

Chromosome and Gene Order Conservation
通过71个马科BAC探针的荧光原位杂交（FISH）证实，NWR与家马（Equus caballus）虽分化52-58百万年，但染色体臂结构和基因顺序高度保守。特别值得注意的是，NWR与SWR的基因组比较显示二者在染色体层面无显著结构变异，支持历史上杂交个体"纳西"的生物学可行性。

Genomic Integrity of the NWR iPSC Lines
基于纳米孔测序的基因组完整性分析流程发现，iPSC系9947-c501在传代40代后获得染色体5q上30 Mb的杂合缺失，该区域对应人类3p24.3-3q24区段，包含TPRG1L等7个生殖细胞功能相关基因。比较分析显示该变异为培养获得性改变，类似人类iPSCs中常见的"培养箱进化"现象。

Discussion
研究建立的CerSimCot1.0基因组填补了奇蹄目濒危物种高质量参考基因组的空白，其应用价值体现在三方面：1）为iPSCs分化人工配子提供基因组质量控制标准；2）证实NWR与SWR基因组兼容性，支持跨亚种代孕方案；3）开发的纳米孔快速检测流程可推广至其他濒危物种。值得注意的是，培养获得的基因组异常（如30 Mb缺失）可能通过影响减数分裂关键基因（SYCP2、TEX12等）而阻碍配子功能，这提示未来需建立更严格的干细胞系筛选标准。

Materials and Methods
样本来自圣地亚哥动物园野生动物联盟"冷冻方舟"（Frozen Zoo^?）保存的NWR成纤维细胞系。基因组组装采用Shasta、Racon和Pilon等工具，注释使用BRAKER3整合多组织RNA-seq数据。FISH实验使用马科BAC探针在6种犀牛物种中验证基因顺序，拷贝数变异分析采用环状二元分割算法处理纳米孔测序数据。