金黄色葡萄球菌（S. aureus）SaeR/S 调控因子突破补体防线助力免疫逃逸机制揭秘

这篇研究聚焦金黄色葡萄球菌（S. aureus）。它是植入物相关感染的常见致病菌，会借多种毒力因子逃避免疫杀伤。研究发现血清补体可抑制其聚集，而S. aureus通过 SaeR/S 系统调控蛋白突破这一防线，揭示了新的宿主防御及细菌逃逸机制，为抗感染治疗提供思路。

　　

研究背景

慢性生物膜感染治疗困难，因其对抗生素和宿主免疫防御具有耐受性。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）常引发与骨科植入物等相关的生物膜感染，且能产生多种干扰宿主免疫的毒力因子。目前对于少量污染细菌如何成功逃避宿主先天免疫防御并发展为严重生物膜感染的机制尚不清楚。此前研究表明，中性粒细胞对表面污染细胞的发现延迟会导致形成难以杀死的生物膜聚集体，且当S. aureus聚集体达到约 50 - 75 μm²时，可抵抗人类中性粒细胞的杀伤并造成其细胞膜损伤。因此，深入了解S. aureus聚集体耐受中性粒细胞杀伤的机制，对明确污染细菌的清除或持续感染过程至关重要。本研究旨在探究S. aureus生物膜聚集体耐受中性粒细胞清除的相关因素，重点研究 SaeR/S 双组分系统和 Agr 群体感应系统调控的基因。

研究方法

1. 细菌菌株和制备：使用多种细菌菌株，包括S. aureus、Staphylococcus epidermidis和Enterococcus faecalis等。将细菌在胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中培养，根据需要添加抗生素，离心、洗涤、调整浓度后接种到培养板上，用不同血清处理后进行后续实验。
2. 中性粒细胞实验：从健康供体的肝素化静脉血中分离人中性粒细胞，在无内毒素条件下操作，评估其纯度和活力。用 LysoBrite? Red 染色后，添加到含有细菌的培养板中，同时加入碘化丙啶（PI），实验结束后收集细菌进行计数。
3. 蛋白质和血清制备：获取健康供体血清，制备热灭活血清（HIS）、眼镜蛇毒因子（CVF）处理的血清、补体成分（C3、C4、C5、因子 B（fB））耗尽的血清等。使用多种试剂处理血清，如 compstatin、eculizumab 等，并制备乙醇沉淀血清、小鼠血清等。
4. 显微镜观察：利用 Leica SP5 或 Stellaris 系列共聚焦激光扫描显微镜进行时间序列成像，在特定环境条件下，对 GFP 标记的细菌、PI 染色的中性粒细胞等进行观察和记录。
5. 图像分析：使用 MetaMorph、ImageJ 和 Imaris 软件对图像进行分析。
6. C3b 表面沉积检测：培养细菌聚集体，用抗体染色后通过共聚焦显微镜观察或流式细胞术检测 C3b 在细菌表面的沉积。
7. RNA 提取和测序：培养细菌，提取 RNA 并进行测序，分析基因表达差异。
8. 统计分析：使用 GraphPad Prism 软件进行统计分析，根据数据正态性选择合适的统计检验方法。

研究结果

1. S. aureus聚集限制中性粒细胞杀伤：通过时间序列共聚焦显微镜观察发现，与未聚集的细胞相比，培养 2 或 3 小时的S. aureus（LAC 菌株）生物膜聚集体对中性粒细胞杀伤具有群体水平的抗性。培养 2 小时后，许多聚集体大小约为 50 - 60 μm²，足以抵抗中性粒细胞的杀伤，并导致中性粒细胞膜损伤。
2. SaeR/S 基因调控系统对生物膜聚集体形成和抵抗中性粒细胞杀伤至关重要：观察 LACΔsae、LACΔagr细胞在人血清中的生长情况，发现 LACΔsae存在严重的聚集缺陷，细胞易从聚集体中脱离；而 LAC 和 LACΔagr细胞能形成致密聚集体。补充sae基因后，LACΔsae的聚集能力恢复。与野生型（WT）相比，LACΔsae聚集体在被中性粒细胞发现时更小，更容易被清除，且中性粒细胞膜损伤程度明显降低；LACΔagr聚集体则与 WT 表现相似。这表明 SaeR/S 而非 Agr 调控的因子对生物膜聚集体形成和抵抗中性粒细胞杀伤至关重要。
3. 血清中生物膜聚集是蛋白质介导的：用蛋白酶 K 处理 WT 聚集体，导致聚集体浓度依赖性地破碎成较小细胞群，细胞更容易脱离；而 DNase 处理则无此效果，说明聚集体形成是蛋白质依赖的机制。通过筛选缺失多种基因的菌株，发现这些基因的缺失均未导致明显的聚集缺陷，进一步表明血清中的聚集机制可能与之前报道的不同。
4. 补体蛋白阻止 SaeR/S 缺失突变体的生物膜聚集：去除血清蛋白或热灭活血清补体后，LACΔsae能够聚集，而 WT 聚集不受影响，表明血清蛋白抑制 LACΔsae聚集。用 CVF 消耗 C3 和 C5、添加 compstatin 抑制 C3 裂解，均能恢复 LACΔsae的聚集。此外，在多种S. aureus菌株以及Staphylococcus epidermidis和Enterococcus faecalis中也观察到类似现象，说明补体蛋白可阻止 LACΔsae聚集，且S. aureus通过 SaeR/S 调控因子克服这种抑制，而其他两种菌缺乏相应防御机制。
5. 抑制 LACΔsae聚集需要替代途径：在 C3 耗尽的血清中，LACΔsae能够聚集且聚集体增大；而在 C5 耗尽的血清中，其聚集情况与在正常血清中相似，表明 C3 而非 C5 是阻止 LACΔsae聚集所必需的。在 C4 耗尽（仅保留替代途径活性）和 fB 耗尽（仅保留经典 / 凝集素途径活性）的血清中培养 LACΔsae，发现经典和凝集素途径在聚集抑制中作用不显著，主要通过替代途径发挥作用。此外，LAC 和 LACΔsae细胞表面的 C3b 调理作用差异不大，说明 C3b 表面沉积本身可能不是聚集差异的主要原因，更可能与干扰 C3b 功能或 C3bBb (C3b) 转化酶活性有关。
6. S. aureus产生多种补体干扰蛋白，共同阻碍补体阻止细菌聚集的能力：对 LAC 和 LACΔsae细胞进行 RNA 测序，发现 LACΔsae中多个已知的补体抑制蛋白基因（如sbi、efb、ecb、scn、scb、eap）表达大幅下调。构建多个基因缺失突变体，发现只有敲除所有 7 个相关基因（LACΔecbΔefbΔsbiΔscnΔscbΔFnbPs，即 ΔC7）的菌株表现出与 Δsae突变体相似的聚集缺陷，在正常血清中无法形成稳定聚集体，在热灭活血清中可聚集。单基因互补实验表明，不同基因对聚集的恢复作用不同，efb和scn的作用较强，sbi次之，ecb和scb有轻微作用。此外，S. aureus在人血浆和小鼠血清中的聚集情况不同，在人血浆中聚集与凝血机制和补体抑制机制相关，而在小鼠血清中，WT LAC 无法聚集，且与 Δsae、ΔC5 和 ΔC7 菌株无明显差异，热灭活小鼠血清可改善所有菌株的聚集，说明小鼠血清中的聚集干扰也依赖补体，但具体机制与人类血清可能存在差异。

研究讨论

S. aureus是多种感染的重要病原体，在生物膜感染中，早期细菌如何逃避宿主免疫防御的研究较少。本研究表明，S. aureus在人血清中可快速形成抵抗中性粒细胞的生物膜聚集体，其形成依赖 SaeR/S 调控因子，血清补体可抑制 LACΔsae聚集体形成，而S. aureus通过多种补体抑制蛋白克服这种抑制，这些蛋白作用于替代途径，干扰 C3 转化酶或 C5 转化酶的功能。此外，研究还发现凝血机制与补体抑制机制在S. aureus聚集中相互独立，且免疫复合物可能参与血清中的聚集过程，但具体机制有待进一步研究。同时，其他细菌可能也存在类似抵抗补体介导聚集抑制的机制，未来可通过合适的动物模型（如兔或非人灵长类动物模型）进一步研究补体介导聚集抑制在发病机制中的作用，明确补体 C3 和 fB 抑制细菌聚集的具体机制，为开发破坏细菌聚集的治疗方法提供依据。