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本文揭示了 TCP3 作为 COP1/SPA 泛素连接酶的非经典底物，通过与 COP1/SPA 相互作用，在黑暗和短日条件下被降解，进而调控拟南芥花青素积累和开花时间，为植物光信号转导研究提供了新视角。
TCP3 与 COP1/SPA 的相互作用及调控机制
光在植物生长发育过程中起着至关重要的作用，它参与了种子萌发、幼苗去黄化、花青素生物合成、避荫反应和开花时间调控等多个生物学过程。植物进化出了专门的光感受器来感知环境光条件，其中光激活的光敏色素、隐花色素和 UVR8 光感受器能够结合并抑制 CULLIN4 - 基于组成型光形态建成 1（CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC 1，COP1） - PHYA - 105 的抑制因子（SUPPRESSOR OF PHYA - 105，SPA1）E3 泛素连接酶，从而促进光形态建成。而 CUL4COP1 - SPA复合物则在黑暗或遮荫条件下作为光形态建成的抑制因子发挥作用，其大多数底物是促进光形态建成的因子，包括转录因子如 HY5、CO 和 PAP2 等。
COP1 是一种在植物和动物中都保守的泛素连接酶，在植物中，它与 SPA 蛋白共同作用，通过促进参与光形态建成的转录因子的降解来抑制黑暗中的光信号。COP1/SPA 复合物由两个 COP1 和两个来自 SPA 蛋白家族（SPA1 - SPA4）的 SPA 蛋白组成，两者对复合物的正常功能都至关重要。从结构上看，COP1 有三个主要结构域：RING 指结构域、卷曲螺旋结构域和 WD 重复结构域；SPA 蛋白也包含三个结构域：激酶结构域（KIN 结构域）、卷曲螺旋结构域和 C 末端 WD 重复结构域。COP1 和 SPA 之间的相互作用依赖于各自的卷曲螺旋结构域，而 COP1 和 SPA 蛋白的 WD 重复结构域则与许多底物中存在的缬氨酸 - 脯氨酸（VP）基序相互作用。
TEOSINTE BRANCHED 1/CYCLOIDEA/PCF（TCP）蛋白是一组植物特异性转录因子，其特征是具有非经典的碱性螺旋 - 环 - 螺旋基序，即 TCP 结构域，该结构域具有 DNA 结合和二聚化功能。在拟南芥中，共有 24 个 TCP 蛋白，根据 TCP 结构域的序列变异分为两个亚类，其中亚类 II 又进一步细分为三个 TB1/CYC 样 TCP（TCP1、TCP12 和 TCP18）和八个 CINCINNATA 样 TCP（CIN - TCPs，包括 TCP2、TCP3、TCP4、TCP5、TCP10、TCP13、TCP17 和 TCP24）。TCP 蛋白可以进行翻译后修饰，包括泛素化和 SUMO 化，并且它们之间的异源二聚化以及与其他转录因子的蛋白质 - 蛋白质相互作用进一步增强了其功能的多样性。
在本研究中，研究人员发现 TCP3 是一种与 COP1/SPA 相互作用的蛋白，但其缺乏与 COP1/SPA 相互作用的经典 VP 基序。研究人员通过酵母双杂交（Y2H）转录因子文库筛选，鉴定出 TCP3 是 COP1 和 SPA1 的结合蛋白，并通过定向 Y2H 实验、烟草荧光素酶互补成像（LCI）、共定位实验和 F?rster 共振能量转移 - 荧光寿命成像显微镜（FRET - FLIM）等实验，在体内和体外证实了 TCP3 与 COP1 和 SPA1 的相互作用。此外，研究还发现 SPA1 能够增强 COP1 与 TCP3 的复合物形成，可能是作为桥梁蛋白并提供额外的 TCP3 相互作用 WD 重复结构域。
进一步研究发现，COP1 和 SPA1 与 TCP3 的相互作用结构域存在部分差异。通过对 COP1 和 SPA1 的缺失衍生物进行实验，发现 COP1 依赖其 WD 重复结构域与 TCP3 相互作用，而 SPA1 则可以通过其 WD 重复结构域和 N 末端结构域与 TCP3 相互作用。同时，研究还发现 TCP3、TCP4 和 TCP10 与 COP1 的相互作用不依赖于 VP 基序，尽管 TCP3 缺乏 VP 基序，但它仍然与 COP1 的 VP 结合口袋相互作用。通过对 TCP3 进行分段实验，确定了其 TCP 结构域负责与 COP1 和 SPA1 相互作用。
TCP3 的降解与稳定性调控
研究人员利用转基因 rTCP3 - GFP/tcpQ 幼苗研究了光条件对 TCP3 蛋白丰度的影响。实验结果表明，黑暗会导致 TCP3 - GFP 蛋白丰度下降，而 MG132 处理可以有效阻止这种下降，说明 TCP3 蛋白在黑暗中通过 26S 蛋白酶体途径被降解。此外，研究还发现红光、蓝光和远红光都能够增强 TCP3 - GFP 蛋白的积累，其中红光和蓝光的效果比远红光更明显。
由于 TCP3 在黑暗中被降解，研究人员推测 E3 泛素连接酶 COP1 可能导致 TCP3 的降解。通过将过表达 TCP3 - GFP 的转基因株系与 cop1 - 4 突变体杂交，研究发现 cop1 - 4 突变体背景下 TCP3 - GFP 的降解速度明显慢于野生型背景，并且在黑暗中，cop1 - 4 突变体背景下 TCP3 - GFP 的多聚泛素化水平也明显低于野生型背景，这表明 COP1 通过多聚泛素化促进了 TCP3 蛋白在黑暗中的降解。
TCP3 对花青素积累的调控作用
先前的研究表明，TCP3 能够增强花青素积累，而 COP1 则会减少花青素生物合成。在本研究中，研究人员通过比较 Col - 0、tcpQ、rTCP3 - GFP/tcpQ 和 cop1 - 4 幼苗在连续白光下的花青素水平，证实了 TCP3 和 COP1 对花青素积累的相反作用。tcpQ 幼苗的花青素水平低于 Col - 0，而 cop1 - 4 幼苗的花青素水平则高于 Col - 0，rTCP3 - GFP/tcpQ 株系的花青素水平高于 tcpQ 突变体，说明 TCP3 - GFP 能够互补 tcpQ 突变体的表型。同时，研究还发现花青素生物合成结构基因（如 CHS、CHI、DFR 和 LDOX）的转录水平与花青素水平一致，而转录因子 PAP1 和 PAP2 的转录水平在不同基因型之间没有差异。
基于 COP1 对 TCP3 蛋白稳定性的负调控作用，研究人员预测 cop1 - 4 突变会增强 TCP3 过表达促进花青素积累的表型。实验结果表明，在黑暗条件下，rTCP3 - GFP/cop1 - 4 株系比 cop1 - 4 积累更多的花青素，而在连续光照条件下，rTCP3 - GFP/Col - 0 株系和 rTCP3 - GFP/cop1 - 4 株系的花青素水平都高于 Col - 0 和 cop1 - 4。此外，研究人员还通过 CRISPR - Cas9 技术在 cop1 - 4 背景下突变 TCP 基因，发现 tcpQCR突变显著降低了 cop1 - 4 在黑暗和光照条件下的花青素含量，说明 TCPs 在 COP1 途径中对花青素生物合成起促进作用。
为了进一步了解 TCP3 增加花青素积累的机制，研究人员进行了双荧光素酶实验。结果表明，TCP3 单独作用时对 DFR 和 LDOX 启动子的表达没有影响，但与 MYB 转录因子 PAP2 和 bHLH 蛋白 TT8 共表达时，能够显著增强 PAP2 和 TT8 的活性，从而诱导 DFR 和 LDOX 启动子的表达，说明 TCP3 可能增强了 MYB - TT8 复合物的活性。
TCP3 对开花时间的调控作用
先前的研究表明，TCP2、TCP3、TCP4 和 TCP10 参与光周期开花，作为开花促进因子，而 COP1/SPA 复合物则在这个过程中起负调控作用。在本研究中，研究人员通过将 rTCP3 - GFP/tcpQ 株系和对照株系在长日（LD）和短日（SD）条件下生长，研究了 TCP3 蛋白在开花过程中的活性和稳定性。结果发现，在 LD 条件下，tcp3/4 和 tcpQ 突变体表现出晚花表型，而 rTCP3 - GFP 的表达能够加速开花，部分互补 tcpQ 突变体的表型；在 SD 条件下，tcp3/4 和 tcpQ 突变体的表型比 LD 条件下弱，rTCP3 - GFP 的表达对 tcpQ 突变体的开花时间和卷曲叶表型的影响较小。
研究人员还测定了 CONSTANS（CO）和 FLOWERING LOCUS T（FT）的 mRNA 水平，发现在 LD 条件下，tcpQ 中 CO 和 FT 的转录水平低于野生型，而 rTCP3 - GFP/tcpQ 株系中 CO 和 FT 的 mRNA 水平高于 tcpQ；在 SD 条件下，tcpQ 突变体中 CO 的转录水平低于野生型，FT 的转录水平不变，rTCP3 - GFP 过表达也没有导致 CO 或 FT 转录水平的增加。这表明 TCP3 是 LD 条件下开花时间的正调控因子，可能通过增加 CO 和 FT 的表达来促进开花，而在 SD 条件下，TCP3 的作用较小。
进一步研究发现，LD 条件下 TCP3 - GFP 蛋白的积累量高于 SD 条件下，这可能是由于 LD 条件下 rTCP3 - GFP 的转录本积累量略高于 SD 条件下，更主要的是 TCP3 蛋白水平受到 SD 条件的负调控。此外，研究还发现 cop1 - 4 突变增强了 TCP3 对开花时间的影响，使 rTCP3 - GFP/cop1 - 4 株系比 cop1 - 4 突变体更早开花，并且 cop1 - 4 突变导致 TCP3 - GFP 蛋白水平升高，CO 转录水平也相应升高，说明 cop1 - 4 突变通过稳定 TCP3 蛋白，促进了 CO 的表达，从而导致更早开花。
研究人员通过构建 TCP3 - GFP/co - 10 植株，发现 TCP3 - GFP 在 co - 10 突变体背景下无法加速开花，说明 TCP3 促进开花的作用依赖于 CO 基因。这进一步证实了 TCP3 通过增加 CO 的表达来促进开花的机制。
研究总结与展望
本研究揭示了 TCP3 作为 COP1/SPA 泛素连接酶的非经典底物，在拟南芥花青素积累和开花时间调控中的重要作用。TCP3 缺乏经典的 VP 基序，但能够与 COP1/SPA 相互作用并被其降解，这表明 COP1/SPA 识别底物的方式比之前认为的更加多样化。此外，研究还发现 TCP3 在花青素生物合成中起到辅助作用，与 MBW 复合物协同促进花青素的积累；在开花时间调控方面，TCP3 在 LD 条件下通过增加 CO 和 FT 的表达来促进开花，而 SD 条件下 TCP3 蛋白水平较低，其促进开花的作用受到限制。
未来的研究可以进一步深入探讨 TCP 家族其他成员与 COP1/SPA 的相互作用，以及这种相互作用在植物生长发育其他过程中的作用机制。同时，通过蛋白质结晶和结构分析等技术，深入研究 TCP3 与 COP1/SPA 相互作用的分子机制，将有助于更全面地理解植物光信号转导网络。此外，研究不同环境条件下 TCP3 和其他 TCP 蛋白的功能变化，以及它们与其他信号通路的相互作用，也将为植物适应环境变化的机制研究提供新的线索。
